Page 48 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第4期
               ·518 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年4月


              施LPS腹腔注射（1 mg/kg），同时Control组和α⁃FMH                1.3  统计学方法
              组给予相同体积的生理盐水。1 d 后进行行为学实                               采用SPSS 19.0软件行统计学分析，所有实验结
              验，实验结束处死大鼠，取其大脑进行生化和形态                            果均以均数±标准差（x ± s）表示。采用单因素方差
              学分析。                                              分析和 LSD⁃t 检验确定差异显著性。P < 0.05 为差
              1.2.2 免疫组织化学染色                                    异有统计学意义。
                  戊巴比妥麻醉大鼠后，灌注250 mL生理盐水和
                                                                2  结 果
              多聚甲醛。取出大脑用4%多聚甲醛固定24 h，然后
              用 20%和 30%的蔗糖梯度脱水。用 OCT 胶包埋脑                      2.1  LPS腹腔注射对大鼠海马区组胺表达的影响
              组织，固定后连续切片（10 μm）。取海马区的脑片，                             大鼠腹腔注射 LPS（1 mg/kg）2、4、6、8、10、12、
              用 PBS 液洗去包埋剂（5 min× 3 次），然后将其放入                   24 h 后取其大脑进行分析。如图 1 所示，腹腔注射

              3% H2O2 （63 mL 甲 醇 ，7 mL 30% H2O2 ）中 浸 泡 10       LPS后4 h，大鼠海马区组胺水平较低，与NS组相比
              min，然后用PBS洗3次。滴加5%BSA 封闭液，室温                      差异无统计学意义。注射后 6~24 h 组胺表达明显
              下封闭 1 h。吸除封闭液后加入 1%BSA 稀释后的                       升高，与NS组相比差异有统计学意义，其中6 h时组

              一抗（1∶200），放入湿盒内4 ℃过夜。第2天用PBS                      胺表达量达峰值，24 h内仍高于基线水平。
              洗 3 遍，滴加对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，孵
                                                                       250
              育1 h洗去多余二抗后加DAB显色。每只大鼠选取3                                                **
                                                                                           **  **
                                                                       200
              张海马CA1区切片，每张切片光镜下（×200）拍摄5张                                                          **  *
              照片。细胞计数采用NIH Image J软件。                                 （ ng/mL）  150
              1.2.3 ELISA检测                                            100
                  切取 20 mg 的脑组织放入离心管中，加入含有                            组胺
                                                                        50
              蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液。于
              冰上进行超声粉碎，超声强度 30 kHz、单次持续时                                 0
                                                                            NS  2 h  4 h  6 h  8 h 10 h 12 h 24 h
              间 10 s，间隔时间 5 s，共 3 个循环。将裂解液离心                                            LPS（1 mg/kg）
              15 min。设空白孔（样本稀释液）、标准孔、待测样本                                 与NS组相比，P < 0.05，P < 0.01（n=6）。
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                                                                                          **
              孔。每孔先加入样本稀释液 50 μL，然后再分别加                                 图1  LPS处理后大鼠海马区组胺的表达
              入空白对照、标准品和样本50 μL，振荡混匀后加上                         Figure 1  Expression of histamine in rat hippocampus
                                                                          after LPS treatment
              封膜，室温下孵育2 h。2 h后揭掉封膜，用洗涤液洗
              涤，并用吸水纸吸干，重复此操作 5 次。然后每孔                          2.2  α⁃FMH可影响LPS诱导的大鼠海马区MG活化
              加入检测抗体 100 μL，室温孵育 2 h 后洗板 5 次。                        本课题组的前期离体实验已证明组胺可以剂
              再每孔加入 100 μL 底物，室温孵育 30 min，此过程                   量依赖性地刺激 MG 激活          ［11］ ，本实验经大鼠侧脑室
              需避光。每孔加入终止液 100 μL 终止反应。酶标                        注射 HDC 抑制剂α⁃FMH，检测海马区 MG 的活化情
              仪测定波长为 450 nm，参考波长为 570 nm，然后检                    况。如图 2 所示，与 Control 组相比，LPS 组与α⁃
              测每孔吸光度。最后通过标准曲线计算 IL⁃6 和                          FMH+LPS 组大鼠海马区 MG 标志物 Iba1 表达明显
              TNF⁃α 的含量。                                        增加；此外与 LPS 组相比，α⁃FMH+LPS 组 Iba1 表达
              1.2.4 逃避恐惧实验                                      下调，说明α⁃FMH可抑制MG的激活。
                  将大鼠放入 TFC 仪器中让其自由探索 100 s。                    2.3  α⁃FMH 可影响 LPS 诱导的大鼠海马区炎症因
              然后先给予大鼠20 s听觉刺激（80 db、5 kHz），后立                   子的表达
              即给予2 s足底电击（0.8 mA）。重复2次，中间间隔                           作为中枢的重要免疫细胞，MG 激活后可释放
              100 s。刺激结束后 100 s 再将大鼠移出仪器，清理                     大量促炎因子加重中枢炎症。通过ELISA技术测定

              仪器底部的排泄物。待给药后，再将大鼠放回 TFC                          大鼠海马区 IL⁃6 和 TNF⁃α的含量。结果如图 3 所
              仪器，无声音及电刺激的干预评估其习得性恐惧记                            示，与 Control 组相比，LPS 组与α⁃FMH+LPS 组大鼠
              忆。由视频追踪软件（Xeye Fcs，北京天鸣鸿远科技                       海马区炎症因子 TNF⁃α和 IL⁃6 的表达增加；与 LPS
              发展有限公司）自动记录大鼠 300 s 内僵直反应（除                       组相比，α⁃FMH+LPS组炎症因子TNF⁃α和IL⁃6的表
              呼吸运动外无其他任何行为活动的状态）时间。                             达显著下降。以上结果提示LPS促进了海马区促炎
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