Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第5期
               ·658 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年5月


              含量增加，构成了血管钙化尤其是血管中膜、外膜                            1.2.2  大鼠平滑肌细胞（rat vascular smooth muscle
                                   ［1］
              钙化的主要细胞学基础 。由于钙化的机制复杂，                            cell，rVSMC）和成纤维细胞（rat vascular adventitial
              目前实际诊疗中尚没有有效的治疗药物。近年来                             fibroblast，rVAF）的提取
              研究表明，低强度脉冲超声（low intensity pulsed ul⁃                  rVAF 的提取：将 3 只健康雄性清洁级 SD 大鼠
              trasound，LIPUS）对机体的细胞和组织具有非灭活                     （180~200 g）麻醉后，在无菌条件下取出大鼠的胸主
              性生物学效应。例如LIPUS可以促进血管内皮细胞                          动脉，放入预冷无菌PBS中暂存。配置1 200 U/mL胶
              的成血管功能 ，促进骨折愈合等 。但LIPUS能否                         原酶消化液，抗生素梯度清洗血管后，转入放有胶
                          ［2］
                                            ［3］
              改善血管钙化尚没有研究报道。本研究拟通过研                             原酶消化液的皿中，摇床消化 30 min（37 ℃、转速
              究 LIPUS 对细胞生物学功能的调节，探索其抑制血                        45 r/min）。用显微器械在体式显微镜下分离主动
              管钙化的效果。                                           脉外膜，将外膜转入加了胶原酶的消化液中，放入
                                                                摇床消化1 h（37 ℃、转速 120 r/min），离心弃上清，加
              1  材料和方法
                                                                入含10 % FBS的DMEM新鲜完全培养基，用100 μm
                                                                                     2
              1.1  材料                                           滤网过滤后转入 25 cm 培养瓶中于 37 ℃、5% CO2
                  大鼠平滑肌细胞、大鼠成纤维细胞来源于南                           培养箱中培养，48 h 观察贴壁后换培养基。细胞
              京市江宁区青龙山动物繁殖场，配制钙化培养                              进行传代培养，选取第 3 代至第 5 代的细胞进行后
              基：DMEM（含 HEPES）高糖培养基，含 1%胎牛血                      续实验。
              清（FBS）、1% 青/链 霉 素 、2 mmol/L 磷 酸 盐（Pi）、                 rVSMC 的提取：抗生素梯度清洗撕去外膜的血
              1.5 mmol/L 钙盐（Ca）。使用的一抗：GAPDH 抗体（#                管，将血管转入含有20% FBS的DMEM新鲜完全培
              5174）、RUNX2 抗体（#12556）（Cell Signaling Tech⁃       养基中，于 37 ℃、5% CO2培养箱中过夜。18 h 后将
              nology 公司，美国），OPN 抗体（#BS1264）（Bioworld            沿血管纵轴剪开，钝物刮除内膜，将血管剪碎后，
              Technology公司，美国），HRP标记的羊抗鼠二抗、羊                    转入胶原酶消化液中，放入摇床消化 2 h（37 ℃、转
              抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司，美国）。            速 50 r/min），弃上清，加有 20% FBS 的 DMEM 新鲜
                                                                                                         2
                               TM
              显影液（SuperSignal West Femto Maximum Sensitivi⁃     完全培养基，用100 μm滤网过滤后转入25 cm 培养
              ty Substrate，Thermo 公司，美国），ChemiDoc XRS 成         瓶中37 ℃，5% CO2培养箱中培养。48 h观察贴壁后
              像系（Bio⁃Rad 公司，美国）。南京医科大学动物保                       换培养基。细胞进行传代培养，选取第3代至第5代
              护及使用委员会批准了所有动物协议。所有涉及                             的细胞进行后续实验。
              动物的程序均按照美国国立卫生研究院出版的《实                            1.2.3 体外诱导rVCMC和rVAF钙化模型的构建
              验动物护理和使用指南》（no.85⁃23；1996年修订）进                         用生理盐水溶解钙、磷后加入 DMEM 培养基
              行，研究方案获得了南京医科大学实验动物管理委                            中，使磷的终浓度达到 2 mmol/L，钙的终浓度达到
              员会的批准（IACUC⁃1906038）。                             1.5 mmol/L，使用高钙磷钙化培养基处理 rVSMC 和
              1.2  方法                                           rVAF72 h。
              1.2.1 实验分组                                        1.2.4 体外细胞模型中低强度脉冲超声处理
                  茜素红染色、钙浓度测定和碱性磷酸酶（alkaline                         低强度脉冲超声刺激是利用一组超声设备进
              phosphatase，ALP）活性测定分为 6 组，包括空白对照                 行的，包括信号发生器（安捷伦科技有限公司，美
              组（Ctrl）、高钙磷处理组（HCa+Pi）、92 mW/cm 声强                国）、宽带功率放大器（罗切斯特电子创新有限公司，
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              LIPUS 处理组（92 mW/cm LIPUS）、14 mW/cm 声强             美国）和平面换能器（重庆海福）。平面换能器频率为
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              LIPUS+高钙磷处理组（14 mW/cm LIPUS+HCa+Pi）、              1 MHz，通过改变电压和刺激周期来施加不同的 LI⁃
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              44 mW/cm 声强 LIPUS +高钙磷处理组（44 mW/cm            2   PUS 强度处理（以声强 mW/cm 表示）。选择 14、
              LIPUS+HCa+Pi）、92 mW/cm 声强 LIPUS+高钙磷处              44、92 mW/cm 3种不同的声强，将传感器（直径6 cm）
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                                                                             2
              理组（92 mW/cm LIPUS+HCa+Pi）。Western blot、           置于水缸中，将细胞培养皿的底部放入传感器中，
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              real ⁃ time PCR 实 验 分 为 4 组 ，包 括 空 白 对 照 组        注入脱气水。细胞悬液暴露于 LIPUS 刺激 5 min
             （Ctrl）、高钙磷处理组（HCa+Pi）、14 mW/cm 声强                  （LIPUS 组），而对照不进行 LIPUS 刺激。在超声波
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              LIPUS 处理组（14 mW/cm LIPUS）、14 mW/cm 声强             处理过程中，培养皿中细胞培养基的温度不超过
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              LIPUS+高钙磷处理组（14 mW/cm LIPUS+HCa+Pi）。              37 ℃。
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