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第41卷第5期 王梦茜，金 燚，夏 凡，等. 肠上皮11β⁃HSD1特异性敲除小鼠的小肠上皮屏障功能的研究［J］.
2021年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（05）：652-656 ·653 ·

皮局部的糖皮质激素过多对肠道功能的影响目前 去。待适当干燥后中性树胶封固。每组于光学显微镜
并不清楚。因此，本文主要研究肠上皮特异性11β⁃ 下随机选取3个PAS染色的组织隐窝区域进行观察。
HSD1 敲除小鼠的肠道上皮屏障功能变化，为肠道 1.2.3 免疫组化
功能研究提供新的思路。 石蜡切片脱水，在组化圈内滴加3%BSA均匀覆
盖组织，室温封闭30 min。去除封闭液，在切片上滴
1 材料和方法
加 PBS 按一定比例配好的一抗（F4/80，GB11027，1∶
1.1 材料 2 000；ZO⁃1，GB11195，1∶300，武汉Servicebio公司），
与南京大学模式动物研究院合作，本研究经实 切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。洗涤后滴加与一

验动物使用及管理委员会审核通过（批准文号：GP⁃ 抗相应种属的二抗（HRP 标记山羊抗兔，GB23303，
TAP002），通过条件性敲除的F1代杂合子与肠道特 1∶200，武汉 Servicebio 公司）覆盖组织，室温孵育

异性的 Lgr5⁃cre 小鼠进行配对繁殖，将获得的 Loxp 50 min。再次洗涤后滴加新鲜配置的 DAB 显色
片段11β⁃HSD1基因敲除鼠以及肠道特异性的Lgr5⁃ 液。苏木素复染3 min 左右，自来水洗后用1%的盐
cre 工具鼠配对繁殖，获得肠道上皮特异性的 11β⁃ 酸酒精分化数秒，自来水冲洗，苏木素分化液分化
HSD1基因敲除的纯合子（11β⁃HSD1 ）小鼠。 数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
-/-
将 C57BL/6 小鼠（6 周，雄性）（南京大学模式动 最后将切片脱水后稍晾干，中性树胶封片。
物研究所）分为 2 组，每组各 8 只，一组给予普通饲 1.2.4 定量方法
料（D12450，10%kcal 脂肪，70%kcal 碳水化合物， HE 染色选取多个视野拍照后测量绒毛、隐窝
20%kcal蛋白质，Research Diets公司，美国），一组给 长度。PAS染色在光学显微镜下选取多个视野计数
予高脂饲料（D12492，60%kcal脂肪，20%kcal碳水化 阳性染色细胞。免疫组化分析使用阳性着色细胞
合物，20%kcal蛋白质，Research Diets公司，美国），喂 计数法，在光学显微镜下，随机多个视野下计数阳
养 8 周。C57BL/6 背景高脂饮食喂养的 11β⁃HSD1 性着色细胞。
（-/-）小鼠（6 周，雄性）（南京大学模式动物研究 1.3 统计学方法
所），8只，喂养8周，饲养在SPF级动物房。 用 GraphPad Prism 9 统计软件进行数据分析，
1.2 方法 计量数据以均数±标准差（x ± s）表示，采用t 检验进
1.2.1 石蜡切片及HE染色 行两组比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
小鼠喂养 8 周后颈椎脱臼法处死，各组分别完
2 结 果
整取出肠道做成圈状，按照常规方法进行固定、洗涤、
脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘片等步骤制备石蜡切 2.1 高脂饮食喂养后小鼠体重变化
片，４℃冰箱保存。取石蜡切片，二甲苯中脱蜡 为了明确高脂饮食对小鼠的影响，对小鼠进行
5 min，新鲜二甲苯再次脱蜡5 min，无水乙醇5 min， 称重，发现与正常饮食野生型小鼠（WT/NC）比较，
90%乙醇2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏 高脂饮食野生型小鼠（WT/HFD）体重明显增加，肠
水2 min，苏木素染液5 min，浸自来水中洗去多余的 上皮11β⁃HSD1特异性敲除小鼠高脂饮食喂养后体
染色液，约 10 min，伊红染液 2 min。70%乙醇洗涤 重也明显增加（图1）。
2 次后脱水，用中性树胶封片。每组于光学显微镜 2.2 高脂饮食导致小鼠小肠上皮绒毛、隐窝、杯状
下随机选取3个HE染色的区域进行观察。 细胞数量变化

1.2.2 过碘酸希夫（periodic acid⁃Schiff，PAS）糖原 为了明确高脂饮食对小肠形态的影响，利用小
染色 肠上皮组织 HE 染色和小肠杯状细胞 PAS 染色，发
取小鼠小肠组织石蜡切片，常规脱水包埋。取 现与正常饮食组小鼠比较，高脂饮食小鼠小肠绒毛
出过碘酸溶液，每个样品滴加过碘酸溶液，在湿盒 长度明显增加，隐窝深度无明显变化，杯状细胞数
中避光反应 10 min 后，去除过碘酸溶液，置于摇床 量较正常饮食组有增多趋势（图2）。上述结果提示
洗涤 5 min。滴加 Schiff 试剂，放入湿盒中，置于 高脂饮食可导致小肠上皮吸收功能增加。
37 ℃烘箱避光染色1 h，去除染色液，置于摇床洗涤 2.3 高脂饮食导致小鼠小肠上皮 ZO⁃1 与 F4/80 表
5 min。每个样品滴加苏木素染色液，染色30 s，去除 达变化
染色液，蒸馏水漂洗2次以上，每次3 s，直到浮色洗 为了进一步研究高脂饮食对小肠上皮屏障功