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第41卷第5期           李珺晗，邱 铭，陆 艳，等. 低强度脉冲超声抑制血管平滑肌和成纤维细胞的钙化［J］.
                  2021年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（05）：657-662                       ·659 ·


                1.2.5 细胞钙浓度测定                                     GTGCTCGTCCTCTACTAC⁃3′；通过实时荧光定量
                    吸去培养基后，用PBS将12孔板中培养的细胞                        PCR（Prism 7900，ABI 公司，美国）系统进行检测。
                清洗3次，每孔加入 500 μL 0.6 mol/L盐酸对细胞进                  所有荧光定量PCR反应均重复3次，用GAPDH将目
                行脱钙处理，放入 4 ℃摇床，24 h 后收集并进行检                       标基因进行标准化。按照对照组将 CT值进行标准
                                            TM                    化，计算各组CT值的变化。
                测。使用试剂盒：QuantiChrom Calcium Assay Kit
               （DICA 500，QuantiChrom 公司，美国）。取5 μL样品               1.2.9 Western blot
                加入 96 孔板，加入 200 μL 工作液，室温振荡 3 min                     将各组细胞用 PBS 漂洗 2 次，根据 Cytoplasmic
                后使用 Synergy   TM  2 microplate reader（BioTek 公司，  Extraction Reagents（Thermo 公司，美国）试剂盒提取
                美国）读取 612 nm 处吸光度。将 12 孔板中液体吸                     细胞蛋白，并在 -70 ℃下保存至直使用。蛋白产物

                净，预冷 PBS 冲洗 3 次后加入 0.1% SDS 或 0.1 mol/L           经 10%~15%的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶分离后转移到
                NaOH 裂解细胞，收集后离心（4 ℃、13 000 g）20 min               PVDF 膜（Roche 公司，瑞士）上，5%BSA 溶液封闭后
                并吸取上清，使用 BCA 法测蛋白浓度（BCA Protein                   孵育一抗，后孵育相对应的 HRP 偶联二抗（1∶5 000
                Assay kit，Thermo Scientific Pierce 公司，美国）。钙       稀释）。使用一抗：GAPDH抗体（#5174）、RUNX2抗
                浓度值计算：标准化钙浓度（μg/mg protein）=绝对钙                   体（#12556）、OPN抗体（#BS1264） ，使用二抗：HRP标
                                                                                              ［4］
                浓度/蛋白浓度。                                          记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗。使用显影液反应 1
                1.2.6 ALP活性测定                                     min 后，在 ChemiDoc XRS 成像系统下曝光。Image
                    吸去培养基后，用 PBS 将 12 孔板中培养的细                     Lab™软件用于条带灰度分析。
                胞清洗 3 次；每孔加入 250 μL 0.05 %的曲拉通 X⁃                 1.3  统计学方法
                100 裂解细胞，3 次冻融后收集孔中液体，离心                              使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，
               （4 ℃、15 000 r/min）15 min 后吸上清液作为样品。                计量数据表示为均值±标准误（x ± sx ）。两组比较选
                使用 ALP 试剂盒（WAKO 公司，日本）。做标准曲                       择t检验，4组数据选择单因素方差分析和Bonferroni
                线，将 100 μL 底物和20 μL 样品加入96 孔板，振荡                  多重比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
                1 min 后 37 ℃孵育 15 min；添加 80 μL 反应终止液，
                                                                  2  结 果
                                           TM
                充分振荡 1 min 后，用 Synergy 2 micro plate reader
               （BioTek 公司，美国）测量405 nm处的吸光度值。同                     2.1  LIPUS对rVSMC钙化的影响
                法测定空白对照和标准品。BCA 法检测样品的总                               分别应用 14、44、92 mW/cm 3个声强 LIPUS 辐
                                                                                               2
                蛋白浓度，根据公式 C×a/（t×M）计算 ALP 活性。C：                   照 rVSMC 1 次（5 min）后，给予高钙磷培养基培养
                由标准曲线得到的吸光度值（实验值与空白值的差                            72 h，结果显示，茜素红染色显示 14~92 mW/cm 的
                                                                                                             2
                值）；t：反应时间（min）；M：样品的总蛋白浓度；a：样                     LIPUS 预处理组细胞钙沉积显著低于对照组，以
                品的稀释倍数。                                           14 mW/cm 最为显著（图1A）。14~92 mW/cm 的 LI⁃
                                                                           2
                                                                                                          2
                1.2.7 茜素红染色                                       PUS 处理组与高钙磷处理组比较，细胞内钙含量明
                    吸取 12 孔板中培养基，PBS 漂洗 3 次；4%甲醛                  显降低（P < 0.001，图1B）。ALP 活性结果表明高钙
                溶液固定 10 min 后用 PBS 漂洗 3 次；95%乙醇固定                 磷处理显著增加了 rVSMC 的 ALP 活性，而 LIPUS 处
                20~30 min，去离子水洗涤 3 遍；2%茜素红 S 染色                   理组与高钙磷处理组相比，降低了细胞内ALP活性
                1 min，显微镜下观察橘红色结节的情况；去离子水洗                       （P < 0.001，图 1C）。
                涤数次至无非特异性染色，使用扫描仪扫描图像。                            2.2  LIPUS对rVAF钙化的影响

                                                                                               2
                1.2.8 实时荧光定量PCR                                       分别应用 14、44、92 mW/cm 3个声强LIPUS 辐
                    使用 RNeasy RNA isolation kit（Qiagen 公司，美       照 rVAF 1 次（5 min）后，给予高钙磷培养基培养 72
                                                                                                2
                国）提 取 rVAF、rVSMC 的 总 RNA，使 用 Prime⁃               h，茜素红染色显示 14、44 mW/cm 的 LIPUS 预处理
                                                                                                         2
                Script TM  RT re⁃agent Kit（TaKaRa 公司，日本）进行        组细胞钙沉积显著低于对照组，92 mW/cm 有下降
                cDNA 合 成 。 引 物 RUNX2：正 向 引 物 5′ ⁃ TCTCA⁃          趋势，但差异无统计学意义（图2A）。14~92 mW/cm                 2
                GATCGTTGAACCTTGCTA⁃3′，反向引物 5′⁃TGGT⁃               的 LIPUS 处理组与高钙磷处理组比较，细胞内钙含
                TACTGTCATGGCGGGTA⁃3′；OPN：正向引物 5′⁃GA⁃              量明显降低（P < 0.01，图 2B）。ALP 活性结果表明
                CACGAAGGTAAAGGTGAC⁃3′，反向引物 5′⁃CTG⁃                高钙磷处理显著增加了rVAF的ALP活性，而LIPUS
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