Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第5期
               ·664 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年5月


                  慢性肝炎是肝硬化的主要病因，全球每年有                           siRNA 转染试剂盒（sc⁃61175，Santa Cruz Biotechnol⁃
              100多万人死于肝硬化，目前中国有多达700万人患                         ogy公司，美国）。
              有肝硬化，而且患病人数不断增加 。肝硬化晚期                                 所有肝脏标本取自南京医科大学第一附属医
                                             ［1］
              患者通常由于肝功能受损、胃食管静脉曲张、腹水                            院肝切除患者。根据 Metavir 评分和病理组织报告
              甚至肝细胞癌而导致预后不良 。                                   对患者肝组织的样本进行分析。正常对照男3例，女
                                         ［2］
                  巨噬细胞在很多人类疾病的发生与发展中起                           2例，年龄（48.3±4.2）岁，肝硬化评分为0~1分；纤维化
              着重要作用，运用巨噬细胞的治疗方案已经用于许                            患者中，男4例，女1例，年龄（58.6±3.5）岁，肝硬化评
              多不同的疾病当中，如肾病、遗传性肺泡蛋白沉积                            分为3~4分。本研究得到南京医科大学第一附属医
              症和肝纤维化 。虽然巨噬细胞在肝脏纤维化中起                            院伦理委员会的批准（伦理批号：2018⁃SRFA⁃197）。
                          ［3］
              重要作用已经被公认，但是巨噬细胞在肝脏纤维化                                 SPF 级 8 周龄的 C57BL/6J 雄性小鼠 20 只，均采
              的发生和发展中的作用机制尚不清楚 。                                购自南京医科大学动物中心。分笼试养，在室温下
                                               ［4］
                  NOD 样受体家族 3（nucleotide⁃binding oligomer⁃      每天予以12 h光照，自由饮水、摄食。
              ization domain⁃like receptors，NLRP3）炎症小体信号        1.2  方法
                                        ［5］
              通路可由多种炎症因子激活 ，其中氧化应激产生                            1.2.1 小鼠分组和模型制备
              的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是NLRP3激               C57BL/6J 小鼠采用腹腔注射四氯化碳（CCL4，
              活的关键因素。应激诱导的ROS通过调节相关信号                           10%橄榄油，2 mL/kg，每周2次，共8周）建立小鼠肝
                                                         ［6］
              通路进而诱导 NLRP3 激活来介导宿主防御反应 。                        脏纤维化模型组；对照组则采用C57BL/6J小鼠腹腔
              NIMA 相关蛋白激酶 7（never in mitosis gene a⁃relat⁃      注射10%橄榄油。巨噬细胞特异性表达甘露糖受体，
              ed kinase 7，NEK7）则是通过 NEK7⁃NLRP3 的相互              运用甘露糖偶联聚合物作为载体，将 NS⁃siRNA 和
              作用从而启动 NLRP3 激活的关键介质，以响应                          NEK7⁃siRNA与甘露糖偶联聚合体混合静置20 min，
                  ［7］
              ROS 。NEK7 和 NLRP3 之间相互结合促进炎症小                     在腹腔注射CCl4造模4 h之前，通过尾静脉注射小鼠
              体的组装以及NLRP3炎症小体的形成，进而导致含                          体内（siRNA 2 mg/kg，每周 2 次，共 8 周），用于特异
              半胱氨酸的天门冬氨酸蛋白水解酶⁃1（cysteinyl as⁃                   性干扰小鼠巨噬细胞中 NEK7 的表达。具体分组：
              partate specific proteinase⁃1，caspase⁃1）的激活，白细    橄榄油+NS⁃siRNA 组，橄榄油+NEK7⁃siRNA 组，
              胞介素（interleukin，IL）⁃1β的分泌和成熟 。因此，                 CCL4+NS⁃siRNA组，CCL4+NEK7⁃siRNA组，每组5只。
                                                   ［8］
              NEK7⁃NLRP3复合体可能在炎症反应过程中起到炎                        1.2.2 组织免疫化学染色
              症小体感受器的作用。本研究即探讨NEK7在肝脏                                所有标本均用10%福尔马林液固定，常规石蜡包
              炎症及纤维化形成中的作用。                                     埋、切片，行免疫组化染色，梯度酒精脱水，丙酮固定，
                                                                抗原修复，加入NEK7抗体过夜，第2天经 PBST 冲洗
              1  材料和方法
                                                                3 次，加入二抗，室温孵育30 min，冲洗3次。
              1.1  材料                                           1.2.3 HE、Masson和天狼星红染色
                  冷冻离心机（Eppendorf 公司，德国）；Veriti PCR                  HE 染色：切片脱蜡处理后，使用苏木素染色液
              仪（Applied Biosystems 公司，美国）；WIX mini 电泳           染色 10 min，蒸馏水洗涤，伊红染色液染色 2 min。
              仪和酶标仪（北京 Wix Technology 公司）；Pannoram⁃             进行乙醇脱水、二甲苯透明，封片剂封片。Masson
              ic DESK扫描仪（3D HISTECH公司，匈牙利）；TRIzol               染色：切片常规脱蜡，依次使用苏木素染色液、Mas⁃
             （Invitrogen 公司，美国）；RNA 反转录试剂盒，SYBR                 son 蓝化液和丽春红品红染色液染色后，弱酸工作
              Green PCR（南京诺唯赞生物科技有限公司）；免疫                       液洗涤，行脱水、透明、封片剂封片。天狼星红染
              组化试剂盒、Masson、天狼星红染色试剂盒（上海碧                        色：切片脱蜡，天狼星红染色液滴染1 h，蒸馏水冲洗
              云天生物技术有限公司）；胎牛血清、DMEM 细胞培                         后，行苏木素染色液染核，行脱水、透明、封片剂封片。
              养基（Gibco公司，美国）；NEK7抗体（Abcam公司，美                   1.2.4 组织免疫荧光染色
              国）；ELISA 试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；                            切片抗原抗体修复与脱蜡处理后，用固定液固
              NLRP3、IL⁃1β、C⁃caspase⁃1和β⁃actin 等抗体（CST 公         定30 min。洗涤液洗涤，用封闭液封闭60 min，去除
              司，美国）；LY6G、CD11b 和 F4/80 等抗体（武汉赛维                 封闭液，用稀释的一抗4 ℃ 孵育过夜，去除一抗，用
              尔生物科技有限公司）；NS⁃siRNA、NEK7⁃siRNA、                   洗涤液洗涤。加入带有荧光标记的二抗避光孵育
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