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第41卷第5期 王艺睿，王 皓，刘硕琛，等. NEK7在慢性肝脏炎症及纤维化形成中的作用［J］.
2021年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（05）：663-669，689 ·665 ·

60 min，洗涤液洗涤，DAPI 染色 60 min，洗涤液洗 织总 RNA，测定浓度，使用反转录试剂盒在 37 ℃
涤，封片剂封片。 15 min，85 ℃ 5 s 的条件下反转录得到 cDNA。在避
1.2.5 Western blot检测 光条件下，将逆转录好的 cDNA 溶液 1 μL，与 0.2 μL
取少量肝脏组织块并用剪刀尽量剪碎，加入 的前引物，0.2 μL 的后引物，5 μL的 SYBR Green，以
500 μL 裂解液后置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 g 及 3.6 μL 无 RNA 酶的 ddH2O 配制成 10 μL 体系。
离心15 min离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度。将 采用2 -ΔΔC t 值计算mRNA 的相对表达量。每组试验
蛋白样本行 SDS⁃PAGE，采用电转膜法将蛋白转移 均重复至少3次。相关引物序列见表1。
至 NC 膜上。采用快速封闭液封闭 30 min 后，分别加 1.2.7 提取纯化肝脏巨噬细胞
入NEK7、IL⁃1β和C⁃caspase⁃1一抗4 ℃孵育过夜，次 用腹腔注射戊巴比妥的方法麻醉 C57BL/6J 小
日加入二抗室温孵育 2 h，加入化学显影液曝光。 鼠，开腹，暴露肝叶下方的门静脉，将留置针插入其
1.2.6 qRT⁃PCR检测 中，拔出针芯，灌注事先预热准备的37 ℃灌注液，肝
取小鼠肝组织研磨后加入 TRIzol 试剂提取组 脏充盈一段时间后，剪断下腔静脉，灌注到流出液

表1 qRT⁃PCR引物序列
Table 1 Sequences of the primers for qRT⁃PCR
基因 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′）
NEK7（人） GCCTTACGACCGGATATGGG CACTAAATTGTCCGCGACCAA
Collagen⁃Ⅰ（人） GAGGGCCAAGACGAAGACATC CAGATCACGTCATCGCACAAC
TIMP⁃1（人） CTTCTGCAATTCCGACCTCGT CCCTAAGGCTTGGAACCCTTT
β⁃actin（人） CATGTACGTTGCTATCCAGGC CTCCTTAATGTCACGCACGAT
NEK7（小鼠） GCTGTCTGCTATATGAGATGGC CCGAATAGTGATCTGACGGGAG
Collagen⁃Ⅰ（小鼠） GCTCCTCTTAGGGGCCACT CCACGTCTCACCATTGGGG
TIMP⁃1（小鼠） GCAACTCGGACCTGGTCATAA CGGCCCGTGATGAGAAACT
Collagen⁃Ⅱ（小鼠） TCGTGCCTAGCAACATGCC TTTGTCAGAATACTGAGCAGCAA
TGF⁃β（小鼠） CCACCTGCAAGACCATCGAC CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
β⁃actin（小鼠） GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

体为清亮液体，再用事先预热准备的具有胶原酶的 脏组织中的表达，分别取 5 例正常肝脏组织和 5 例
37 ℃灌注液，一直灌注至肝脏柔软。取出肝脏，去 肝纤维化患者肝脏组织包埋切片，通过 HE 和 Mas⁃
除多余组织，放置消化液中静置15 min，通过无菌滤 son 染色观察发现，肝硬化患者较正常肝脏组织肝
嘴过滤，收集过滤后的组织液体，50 g离心2 min，取 纤维化更为明显（图 1A）。通过 qRT⁃PCR 技术检测
上清液体500 g离心8 min，然后用培养基重悬沉淀， 对比发现肝纤维化患者纤维化相关指标金属蛋白
分别采用 3 mL 的 50%Percoll 液、25%Percoll 液和 3 酶组织抑制因子 1（tissue inhibitor of metalloprotein⁃
mL的细胞悬浮液铺层，800 g离心15 min，吸取中间 ases 1，TIMP1）和Ⅰ型胶原蛋白（Collagen⁃ Ⅰ）的
一层至离心管中，500 g 离心 8 min，培养基重悬沉 RNA 水平明显升高（图1B）。同时采用qRT⁃PCR 技
淀，铺板，30 min 后换液，留下贴壁细胞，用于 West⁃ 术及 Western blot 技术检测表明，NEK7 mRNA 和蛋
ern blot检测NEK7⁃siRNA的干扰效率。 白的表达水平在纤维化肝脏组织明显高于正常肝

1.3 统计学方法 脏组织（图1C）。此外，通过免疫组织荧光染色技术
统计学分析及相关绘图通过 GraphPad Prism 6 发现CD68阳性细胞中NEK7的表达量显著增加（图
软件实现。所有实验数据均以均数±标准差（x ± s） 1D）。这些结果表明在肝纤维化患者的肝脏组织中
表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采 NEK7表达上调，尤其是在巨噬细胞当中。
用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。 2.2 干扰小鼠巨噬细胞中NEK7的表达对肝脏纤维
化的影响
2 结 果
通过 HE、Masson 和天狼星红组织化学染色技
2.1 NEK7在肝纤维化患者肝脏组织中的表达 术，观察到未经过腹腔注射CCL4的小鼠肝脏无明显
为了检测NEK7在正常肝脏及肝纤维化患者肝 纤维化，然而采用 CCL4腹腔注射的小鼠当中，NS⁃