Page 42 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第5期
               ·672 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年5月


              面能以评价各组试件的表面亲水性。                                  测成骨分化相关蛋白骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、
              1.2.3 细胞培养                                        锌指结构转录因子（osterix，OSX）、骨钙蛋白（osteo⁃
                  体外复苏 MC3T3⁃E1 成骨细胞，加入α⁃MEM 培                  calcin，OCN）的表达水平，Photoshop 软件测定蛋白
              养基（含10%胎牛血清、1%青⁃链霉素），于细胞恒温                        条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。
              培养箱（37 ℃、95% 相对湿度、5% CO2 ）内静置培                    1.2.7  碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性
              养。每3 d换液，细胞密度达 80%后1∶4传代。                         检测
              1.2.4 细胞黏附观察                                           将 4 组钛片置于 6 孔板中，分别以不同介质保
                  选用直径5 mm、厚1 mm的纯钛片打磨抛光、超                      存 2 周，弃存储液后用 PBS 漂洗 3 遍，将 MC3T3⁃E1
              声清洗后置于 96 孔板中，分别以空气、生理盐水、                         细胞以2×10 个/孔的密度接种于4组钛片表面培养
                                                                           5
              BSA 溶液、Ag2S@BSA 溶液密闭存储 2 周，弃存储液                   7 d后，RIPA冰上裂解30 min，收集裂解液离心后取
              后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）漂            上清，采用 BCA 试剂盒检测蛋白浓度，碱性磷酸酶
              洗 3 遍，将 MC3T3⁃E1 细胞（5×10 个/孔）接种于 4 组              测试盒测定ALP活性。
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              材料表面孵育8 h，4%多聚甲醛4 ℃固定过夜，鬼笔                        1.3  统计学方法
              环肽室温下避光染色 30 min，DAPI 室温下避光染                           采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析，数据以均
              色 2 min。激光共聚焦显微镜下随机选取视野观察                         数±标准差（x ± s）表示，对亲水性、细胞增殖、ALP活
              各组试件表面细胞黏附形态。                                     性和蛋白相对表达数据进行方差齐性检验，显示方
              1.2.5 CCK⁃8法检测细胞增殖活性                              差齐，进行单因素方差分析和 SNK 多重比较，P <
                  每组各选用3枚纯钛片置于96孔板中，分别以                         0.05为差异有统计学意义。
              4 种介质密闭存储 2 周，弃存储液后用 PBS 漂洗
                                                                2  结 果
              3 遍，将 MC3T3⁃E1 细胞（2×10 个/孔）接种于4组试
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              件表面。培养1、3、6 d后，加入200 μL新鲜配制的                      2.1  表面微形貌
              CCK⁃8 液 37 ℃孵育 2 h，多功能酶标仪检测各孔在                         扫描电镜观察纯钛试件在4种介质中存储2周
              波长450 nm下的吸光度。                                    后的表面形貌见图 1。低倍镜下观察 4 组试件表面
              1.2.6  蛋白印迹法（Western blot）检测成骨相关蛋                 平坦，均可见整齐的机械划痕。高倍镜下生理盐水
              白表达                                               组钛表面可见散在分布的晶体，Ag2S@BSA 组钛表
                  将 4 组钛片置于 6 孔板中，在 4 种条件下保存                    面均匀分布纳米级颗粒。该结果表明，钛表面经 4
              2 周后用 PBS 漂洗 3 遍，将 MC3T3⁃E1 细胞以 2×                种 介 质 存 储 2 周 后 ，表 面 微 形 貌 无 明 显 改 变 ，
              10 个/孔的密度接种于4组钛片表面培养7 d后，提                        Ag2S@BSA 溶液浸泡后可形成大小均一的纳米级颗
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              取细胞总蛋白。以 GAPDH 为内参，Western blot 检                 粒吸附于钛片表面。

                          空气                    生理盐水                    BSA溶液                Ag2S@BSA溶液




               ×2 000



                                  20 μm                   20 μm                  20 μm                   20 μm




               000
               ×10


                                   5 μm                   5 μm                    5 μm                    5 μm

                                        图1 纯钛试件在不同介质中存储2周后的扫描电镜图像
                              Figure 1  SEM images of titanium specimens stored in different media for 2 weeks
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