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第41卷第6期     冯 恬，龚丹丹，王露瑶，等. 人源抗c⁃Met抗体与rAGAP偶联物对卵巢癌细胞生物学特性的影响［J］.
                  2021年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：817-825                       ·819 ·


                PBST 洗涤后加入 HRP 标记的二抗室温孵育1 h，曝                     胞悬液，并于下室中加入600 μL含15％FBS的培养
                光仪曝光。                                             基，37 ℃ 5% CO2孵箱中培养48 h。用4％多聚甲醛
                    亲和力检测：将重组人 c⁃Met 抗原用缓冲液                       固定下室30 min，结晶紫染色20 min后，用棉签擦去
                Kinetic buffer稀释至5 μg/mL后在传感器上固化，再                上室中未穿过的细胞，在显微镜下观察、拍片和计
                将抗体c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP分别用缓冲               数分析。
                液 Kinetic buffer 进行梯度稀释，各浓度的两种抗体                  1.3  统计学方法
                分别与已固化 c⁃Met 抗原的传感器进行结合反应，                            应用 Stata 12.0 和 Graphpad 5.0 对数据进行统
                结合反应时间为240 s。待结合反应完成后，将传感                         计学分析，实验数据用均数±标准差（x ± s）表示，两
                器转入 Kinetic buffer 缓冲液进行解离，解离时间为                  组样本均数间比较采用配对 t 检验，多组间比较采

                900 s。最后将实验数据导入软件（DATA Analysis                   用单因素方差分析，两两比较采用 LSD⁃t 检验，P＜
                HT 12.0）进行分析。                                     0.05为差异有统计学意义。

                    免疫荧光：将HO8910和IOSE386细胞培养在6
                                                                  2  结 果
                孔板中，细胞汇合度为 80%时，用 4％多聚甲醛 4 ℃
                固定 20 min，5%脱脂奶粉溶液封闭 1 h 后分别用两                    2.1  重组 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 真核表
                种抗体孵育 2 h，再用羊抗人 IgG1⁃FITC 抗体避光孵                   达载体的构建
                育 1 h，DAPI 染液染核 20 min 后用 LSM 800 激光共                 凝胶电泳鉴定结果显示：c⁃Met⁃IgG1⁃H、c⁃Met⁃
                聚焦显微镜观察拍照。                                        IgG1⁃L、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP⁃L 基因的大小分别为
                    流式细胞术：将 HO8910 和 IOSE386 细胞，消化                1 500 bp、750 bp、900 bp，与预期结果相符。将目的
                重悬计数，每管计数细胞5×10 个，将每种细胞分为                         条带分别与线性化的 pMH3质粒相连接完成真核表
                                           5
                4组，分别为PBS组、FITC组、c⁃Met⁃IgG1组及c⁃Met⁃               达载体的构建（图1）。将重组后的真核表达载体质
                IgG1⁃rAGAP 组。5%脱脂奶粉溶液 37 ℃温箱封闭 1                  粒分别转入DH5α，通过NoTⅠ和EcoRⅠ双酶切筛选
                h 后，依次加入 PBS、PBS、c⁃Met⁃IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃           出阳性克隆送公司测序，证实与设计序列完全相同。
                rAGAP 后 37 ℃温箱孵育 1 h，之后向 PBS 组加入                  2.2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的表达与纯化
                PBS，其余组都加入 FITC 标记 Fc 特异性的羊抗人                         将c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的重组质粒
                IgG1，室温避光孵育 1 h 后洗涤，150 μL PBS 重悬细                分 别 电 转 染 CHO ⁃ S 细 胞 ，用 含 G418 硫 酸 盐 的
                胞，流式细胞仪检测分析。                                                M   1  2  3  4  5  6  7
                1.2.4  c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细
                                                                     10 000
                胞生物学特性的影响                                             7 000
                    CCK⁃8实验：将HO8910细胞及IOSE386细胞消                      4 000
                                    3
                化重悬后按每孔 8×10 个细胞数铺 96 孔板，c⁃Met⁃
                                                                      2 000
                IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 和 PA⁃IgG 分别设置 5 个浓                                               1 500 bp
                度梯度：0、25、50、100、200 μg/mL，每个浓度设置3个                    1 000                            900 bp
                                                                                                       700 bp
                复孔。37 ℃ 5%CO2孵箱中培养 48 h。实验结束时                          500
                弃去原培养基，向每孔加入100 μL DEME培养基和                            250
                10 μL CCK8，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测450 nm处的
                吸光度值。                                                M：DL10 000 bpDNA 标准分子量；1：pMH3 质粒空载；2：重组质
                                                                  粒pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃H；3：重组质粒pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP ⁃L；4：
                    划痕实验：将 HO8910 细胞和 IOSE386 细胞分
                                                                  重组质粒pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃L；5：pMH3⁃ c⁃Met⁃IgG1⁃H酶切得c⁃Met⁃
                别接种到 24 孔板培养至细胞汇合度为 80%，用 200
                                                                  IgG1⁃H；6：pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP ⁃L酶切得c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP⁃L；
                μL 移液管径直划出 1 条直线，PBS 洗涤后分别用                       7：pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃L酶切得c⁃Met⁃IgG1⁃L。
                200 μg/mL c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP处理，并         图 1  c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 真核表达载体的
                于0 h、24 h、48 h在显微镜下拍照、测量。                              构建与鉴定
                    Transwell 侵袭实验：将 HO8910 和 IOSE386 细           Figure 1  Construction and identification of recombinant
                                                                           c⁃Met⁃IgG1 and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP eukaryot⁃
                胞培养至对数生长期，每种细胞 PBS 组、c⁃Met⁃
                                                                           ic expression vectors
                IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP。向小室中加入 200 μL 细
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