Page 42 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第6期
·820 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年6月

DMEM/F12 培养基筛选获得阳性细胞，经Dot blot及 A 1 2 3
亚克隆筛选出能够高效表达抗体的单克隆细胞株
（图2A）。将定株的细胞悬浮培养以收集细胞上清，
B
M 1 2 3 4 5 6 7
用 Protein A 柱纯化，获得 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃
180
130
rAGAP 两种抗体。将上清液、流穿液及纯化所得的 100
抗体进行 SDS⁃PAGE 凝胶电泳，结果显示纯化后的 70
55 55 kDa
抗体条带大小与预期相符且无明显杂带（图2B）。 40
2.3 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 生物学特性 35 38 kDa
分析 25 30 kDa
2.3.1 c⁃Met⁃IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的亲和力测定
A：c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 的 Dot blot 检测。1：正常
重组人 c⁃Met 抗原用缓冲液 Kinetic buffer 稀释
CHO⁃S细胞上清点样；2：表达c⁃Met⁃IgG1细胞上清点样；3：表达c⁃Met⁃
后在传感器上固化，将 c⁃Met⁃IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃ IgG1⁃rAGAP细胞上清点样。B：c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的
rAGAP抗体梯度稀释后与其反应，结果显示，c⁃Met⁃ SDS⁃PAGE电泳。M：蛋白Marker；1：CHO上清；2：纯化前表达c⁃Met⁃
IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与重组人c⁃Met抗原结合 IgG1的细胞上清；3：纯化的c⁃Met⁃IgG1抗体；4：表达c⁃Met⁃IgG1的细胞
上清流穿；5：纯化前表达c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的细胞上清；6：纯化的c⁃
-8
的亲和力分别为 5.607×10 mol/L（图 3A）和 8.389×
Met⁃IgG1⁃rAGAP抗体；7：表达c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的细胞上清流穿液。
10 mol/L（图3B）。 图2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的纯化与鉴定
-8
2.3.2 qRT⁃PCR检测卵巢癌细胞c⁃Met mRNA的表达 Figure 2 Purification and identification of c ⁃ Met ⁃ IgG1
根据 RNA 提取试剂盒说明书提取 HO8910、 and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP

A B
（ nm ） 0.3 （ nm ） 0.3
干涉光谱图位移 0.2 干涉光谱图位移 0.2

0.1
0.1
0
-200 0 200 400 600 800 1 000 0 -200 0 200 400 600 800 1 000
时间（s） 时间（s）
A：c⁃Met⁃IgG1与重组人c⁃Met蛋白亲和力检测结果；B：c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与重组人c⁃Met蛋白亲和力检测结果。
图3 c⁃Met⁃IgG1及c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与重组人c⁃Met抗原的亲和力检测
Figure 3 Affinity detection of c⁃Met⁃IgG1 and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP with recombinant human c⁃Met antigen

IOSE386细胞总RNA后分别逆转录成cDNA，用qRT⁃ 50 *
PCR 方法检测细胞中 c⁃Met 的 mRNA 表达水平。 40
qRT⁃PCR 分析显示，HO8910 细胞中的 c⁃Met mRNA 30
明显高于IOSE386细胞（图4）。 c⁃Met mRNA相对表达水平 20
2.3.3 Western blot 检测卵巢癌细胞c⁃Met蛋白的表达
c⁃MET 阳性的 HO8910 细胞可检测到 c⁃Met 蛋 10
白的前体（170 kDa）和成熟体（140 kDa），而未在 0
IOSE386 HO8910
IOSE386 细胞中检测到c⁃Met蛋白（图5）。 两组比较，P < 0.001（n=3）。
*
2.3.4 免疫荧光检测 图4 qRT⁃PCR 检测卵巢癌细胞c⁃Met mRNA的表达
Figure 4 Detection of c⁃Met mRNA expression in ovarian
共聚焦显微镜下观察本研究制备的c⁃Met⁃IgG1
和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 与细胞的结合特性及其在细 cancer cells by qRT PCR

胞中的定位。结果显示 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃ 2.3.5 流式细胞术检测 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃
rAGAP 可以与细胞膜上 c⁃Met 蛋白特异性结合 rAGAP与抗原的结合能力
（图 6）。 流式细胞术检测 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃