Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 40

第41卷第6期
               ·818 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年6月


                  卵巢癌作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，是妇                          邦公司），DMEM 及 DMEM/F12 培养基（Gibco 公司，
                                        ［1］
              科恶性肿瘤死亡的主要原因 。尽管减瘤手术、铂                            美国），限制性内切酶 EcoRⅠ、NoTⅠ（Invitrogen 公
              类为主的化学疗法、免疫疗法等多种治疗方法取得                            司，美国），T4 连接酶（Takara 公司，日本），电转杯
              了一定进步，但早期诊断困难、化疗耐药、复发率                            （Bio⁃rad公司，美国），0.22微米滤膜（Millipore公司，
              高、预后不良等一系列问题仍然困扰着相关医疗工                            美国），Protein A 亲和纯化柱（GE 公司，美国），重组
                  ［2］
              作者 。因此，人们急需研究出一种能够有效改善卵                           人c⁃Met蛋白（R＆D公司，美国），HRP标记抗人Fab
              巢癌患者治疗效果特别是减少化疗耐药发生的治疗                            和 FITC 标记抗人 Fc 的特异性抗体（Sigma 公司，美
                  ［3］
              方法 。抗体药物偶联物（antibody drug conjugate，              国），CCK8试剂盒（Dojindo公司，日本），Transwell小
              ADC）是将毒素或药物与单克隆抗体偶联的一种靶向                          室（Corning 公司，美国），DAPI、结晶紫染液（上海碧
              疗法，它可以作为一种新型的靶向疗法应用于卵巢癌                           云天公司），G418硫酸盐、DH5α（上海生工公司）。
              的治疗，将细胞毒性药物传递至癌细胞，降低对正常                           1.2  方法
              组织细胞毒性的同时，增强疏水化合物的溶解度和延                           1.2.1 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP真核表达载体的构建
              长血浆半衰期，以发挥抗肿瘤的活性               ［4-5］ 。                 为制备 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 真核表达载体，首
                  作为ADC的关键成分之一的单克隆抗体，需要                         先，以 pUC57⁃c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 载体为模板，PCR
              高度选择性地作用于靶细胞上的抗原，研究表明                             扩增获得与rAGAP 基因相偶联的轻链（c⁃Met⁃IgG1⁃
              c⁃Met 在 60％的卵巢癌患者肿瘤中呈过表达，与卵                       L⁃rAGAP）编码序列，NoTⅠ和EcoRⅠ双酶切后与同
                                   ［6］
              巢癌发生以及预后相关 。c⁃Met 是由 MET 原癌基                      样双酶切的 pMH3 载体相连，转化 DH5α，通过 NoT
              因编码，通过二硫键连接的由高度糖基化的50 kDa                         Ⅰ和EcoRⅠ双酶切和测序鉴定阳性克隆，从而成功
              α亚基和跨膜 145 kDa β亚基组成的异二聚体                  ［7］ 。  构建pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃L⁃rAGAP真核表达载体。
              c⁃Met与配体肝细胞生长因子（hepatocyte growth fac⁃            1.2.2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的表达和鉴定
              tor，HGF）结合后被激活，通过触发下游磷酸肌醇3⁃                            通过电转染将重链和轻链真核表达载体共转
              激酶（PI3K）/ Akt通路诱导肿瘤细胞增殖、迁移和侵                      进 CHO⁃S 细胞，以含 G418 硫酸盐的 DMEM/F12 培
              袭 ［8-9］ 。因此，可以通过靶向c⁃Met阻断HGF和c⁃Met                养基进行筛选，通过Dot blot和亚克隆筛选高效表达
              间的相互作用达到有效治疗卵巢癌的目的                     ［10］ 。另    抗体的细胞株，将培养定株的细胞重悬，收集细胞
              外，蝎毒对某些肿瘤具有显著的防治作用，其有效                            上清液，用 0.22 μm 滤膜过滤收集细胞上清液，AK⁃
              组分在癌症治疗方面已取得了显著效果                    ［11］ 。东亚     TA 蛋白纯化系统和 Protein A 亲和层析柱纯化；用
              钳蝎镇痛抗肿瘤多肽（analgesic⁃antitumor peptide，            SDS⁃PAGE 检测 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 的
              AGAP）是从蝎毒多肽中分离出来的一种毒素，不仅                          目的蛋白。
              具有镇痛作用，还能对胆管细胞癌                ［12］ 、肝癌 ［13］ 、脑胶  1.2.3  c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP生物学特性
              质瘤  ［14］ 、乳腺癌 ［15］ 等多种恶性肿瘤起到抑制作用。                 分析
              因此从东亚钳蝎蝎毒中提取纯化出的重组镇痛抗                                  实时荧光定量 PCR（qRT⁃PCR）：培养 HO8910、
              肿瘤多肽（recombinant analgesic⁃antitumor peptide，     IOSE386至对数生长期，利用RNA提取试剂盒提取细
              rAGAP）有望成为构建ADC的小分子细胞毒素 。                         胞总RNA，测量调整RNA浓度，然后应用PCR扩增仪
                                                       ［16］
                  本研究制备人源抗c⁃Met的全分子抗体（c⁃Met⁃                    将RNA逆转录成cDNA，10 μL cDNA稀释4倍，将其
              IgG1）及其与 rAGAP 偶联的新型抗体（c⁃Met⁃IgG1⁃                作为qRT⁃PCR模板。qRT⁃PCR反应体系为20 μL，反
              rAGAP），分析它们的生物学特性，检测其对卵巢癌                         应条件为94 ℃ 5 s；60 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，
              细胞生物学行为的影响。                                       40 次循环；每个样品均设3个复孔，记录Ct值。c⁃Met

                                                                的 mRNA 相对表达量根据 2           - △ △ Ct  方法分析计算，
              1  材料和方法
                                                                GAPDH用作内部参考。
              1.1  材料                                                Western blot：培养 HO8910、IOSE386 细胞至对
                  CHO⁃S 细胞、人卵巢癌细胞系 HO8910、人正常                   数生长期，接种到 6 孔板，在细胞培养箱中培养过
              卵巢上皮细胞IOSE386、pMH3质粒、抗c⁃Met抗体的                    夜，裂解细胞提取总蛋白，加入蛋白上样缓冲液后，
              载体及人源抗炭疽保护性抗原PA 抗体（PA⁃IgG）均                       100 ℃煮15 min，上样进行蛋白电泳，转NC膜后5％
              由本实验室提供和保存。CHO悬浮培养基（上海迈                           脱脂奶粉溶液封闭1 h，抗c⁃Met抗体4 ℃孵育过夜，
   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45