Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第6期
·818 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年6月
卵巢癌作为最常见的妇科恶性肿瘤之一,是妇 邦公司),DMEM 及 DMEM/F12 培养基(Gibco 公司,
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科恶性肿瘤死亡的主要原因 。尽管减瘤手术、铂 美国),限制性内切酶 EcoRⅠ、NoTⅠ(Invitrogen 公
类为主的化学疗法、免疫疗法等多种治疗方法取得 司,美国),T4 连接酶(Takara 公司,日本),电转杯
了一定进步,但早期诊断困难、化疗耐药、复发率 (Bio⁃rad公司,美国),0.22微米滤膜(Millipore公司,
高、预后不良等一系列问题仍然困扰着相关医疗工 美国),Protein A 亲和纯化柱(GE 公司,美国),重组
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作者 。因此,人们急需研究出一种能够有效改善卵 人c⁃Met蛋白(R&D公司,美国),HRP标记抗人Fab
巢癌患者治疗效果特别是减少化疗耐药发生的治疗 和 FITC 标记抗人 Fc 的特异性抗体(Sigma 公司,美
[3]
方法 。抗体药物偶联物(antibody drug conjugate, 国),CCK8试剂盒(Dojindo公司,日本),Transwell小
ADC)是将毒素或药物与单克隆抗体偶联的一种靶向 室(Corning 公司,美国),DAPI、结晶紫染液(上海碧
疗法,它可以作为一种新型的靶向疗法应用于卵巢癌 云天公司),G418硫酸盐、DH5α(上海生工公司)。
的治疗,将细胞毒性药物传递至癌细胞,降低对正常 1.2 方法
组织细胞毒性的同时,增强疏水化合物的溶解度和延 1.2.1 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP真核表达载体的构建
长血浆半衰期,以发挥抗肿瘤的活性 [4-5] 。 为制备 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 真核表达载体,首
作为ADC的关键成分之一的单克隆抗体,需要 先,以 pUC57⁃c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 载体为模板,PCR
高度选择性地作用于靶细胞上的抗原,研究表明 扩增获得与rAGAP 基因相偶联的轻链(c⁃Met⁃IgG1⁃
c⁃Met 在 60%的卵巢癌患者肿瘤中呈过表达,与卵 L⁃rAGAP)编码序列,NoTⅠ和EcoRⅠ双酶切后与同
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巢癌发生以及预后相关 。c⁃Met 是由 MET 原癌基 样双酶切的 pMH3 载体相连,转化 DH5α,通过 NoT
因编码,通过二硫键连接的由高度糖基化的50 kDa Ⅰ和EcoRⅠ双酶切和测序鉴定阳性克隆,从而成功
α亚基和跨膜 145 kDa β亚基组成的异二聚体 [7] 。 构建pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃L⁃rAGAP真核表达载体。
c⁃Met与配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth fac⁃ 1.2.2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的表达和鉴定
tor,HGF)结合后被激活,通过触发下游磷酸肌醇3⁃ 通过电转染将重链和轻链真核表达载体共转
激酶(PI3K)/ Akt通路诱导肿瘤细胞增殖、迁移和侵 进 CHO⁃S 细胞,以含 G418 硫酸盐的 DMEM/F12 培
袭 [8-9] 。因此,可以通过靶向c⁃Met阻断HGF和c⁃Met 养基进行筛选,通过Dot blot和亚克隆筛选高效表达
间的相互作用达到有效治疗卵巢癌的目的 [10] 。另 抗体的细胞株,将培养定株的细胞重悬,收集细胞
外,蝎毒对某些肿瘤具有显著的防治作用,其有效 上清液,用 0.22 μm 滤膜过滤收集细胞上清液,AK⁃
组分在癌症治疗方面已取得了显著效果 [11] 。东亚 TA 蛋白纯化系统和 Protein A 亲和层析柱纯化;用
钳蝎镇痛抗肿瘤多肽(analgesic⁃antitumor peptide, SDS⁃PAGE 检测 c⁃Met⁃IgG1 和 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP 的
AGAP)是从蝎毒多肽中分离出来的一种毒素,不仅 目的蛋白。
具有镇痛作用,还能对胆管细胞癌 [12] 、肝癌 [13] 、脑胶 1.2.3 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP生物学特性
质瘤 [14] 、乳腺癌 [15] 等多种恶性肿瘤起到抑制作用。 分析
因此从东亚钳蝎蝎毒中提取纯化出的重组镇痛抗 实时荧光定量 PCR(qRT⁃PCR):培养 HO8910、
肿瘤多肽(recombinant analgesic⁃antitumor peptide, IOSE386至对数生长期,利用RNA提取试剂盒提取细
rAGAP)有望成为构建ADC的小分子细胞毒素 。 胞总RNA,测量调整RNA浓度,然后应用PCR扩增仪
[16]
本研究制备人源抗c⁃Met的全分子抗体(c⁃Met⁃ 将RNA逆转录成cDNA,10 μL cDNA稀释4倍,将其
IgG1)及其与 rAGAP 偶联的新型抗体(c⁃Met⁃IgG1⁃ 作为qRT⁃PCR模板。qRT⁃PCR反应体系为20 μL,反
rAGAP),分析它们的生物学特性,检测其对卵巢癌 应条件为94 ℃ 5 s;60 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,
细胞生物学行为的影响。 40 次循环;每个样品均设3个复孔,记录Ct值。c⁃Met
的 mRNA 相对表达量根据 2 - △ △ Ct 方法分析计算,
1 材料和方法
GAPDH用作内部参考。
1.1 材料 Western blot:培养 HO8910、IOSE386 细胞至对
CHO⁃S 细胞、人卵巢癌细胞系 HO8910、人正常 数生长期,接种到 6 孔板,在细胞培养箱中培养过
卵巢上皮细胞IOSE386、pMH3质粒、抗c⁃Met抗体的 夜,裂解细胞提取总蛋白,加入蛋白上样缓冲液后,
载体及人源抗炭疽保护性抗原PA 抗体(PA⁃IgG)均 100 ℃煮15 min,上样进行蛋白电泳,转NC膜后5%
由本实验室提供和保存。CHO悬浮培养基(上海迈 脱脂奶粉溶液封闭1 h,抗c⁃Met抗体4 ℃孵育过夜,