Page 71 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第7期 吴 茗，徐 睿，刘书娜，等. 卵巢癌细胞生长环境中CD4 Treg细胞和CD4 Teff细胞的糖
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2021年7月 代谢特征初探［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：999-1005 ·1001 ·
α）、磷酸丙糖异构酶 1（triose⁃phosphate isomerase1， 胞以及与 SKOV3 细胞共培养后的 CD4 Treg、Teff 细
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TPI1）的 mRNA 表达水平。引物序列见表 1。扩增 胞，PBS洗涤细胞2次去上清，加入适量蛋白裂解液
程序：预变性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 提取细胞总蛋白，用 BCA 法定量检测蛋白浓度，配
34 s，40个循环；72 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 制10%分离胶和4%浓缩胶，将变性的蛋白样品加入
95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s；结束反应。 各泳道，同时以蛋白 Marker 作分子量对照，80 V 电
1.2.4 细胞总蛋白提取和Western blot实验 压下电泳至样品全部到达分离胶，改电压为 100 V
收集与 SKOV3 细胞共培养前后的 CD4 Treg 细 继续电泳适当时间，至 Loading buffer 电泳至胶板底
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表1 PCR引物序列一览表
Table 1 PCR primer sequences
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′）
Glut1 TTGGCTCCGGTATCGTCAAC GCCAGGACCCACTTCAAAGA
Glut3 GCTCTCTGGGATCAATGCTGTGT CTTCCTGCCCTTTCCACCAGA
ENO1 TCATCAATGGCGGTTCTCA TTCCCAATAGCAGTCTTCAGC
GPI AGGCTGCTGCCACATAAGGT AGCGTCGTGAGAGGTCACTTG
TPI1 AGGCATGTCTTTGGGGAGTC AGTCCTTCACGTTATCTGCGA
HIF⁃1α CCATTAGAAAGCAGTTCCGC TGGGTAGGAGATGGAGATGC
LDH⁃α CCAGCGTAACGTGAACATCTT CCCATTAGGTAACGGAATCG
PKM2 GCCGCCTGGACATTGACTC CCATGAGAGAAATTCAGCCGAG
β⁃actin GAGCTACGAGCTGCCTGACG GTAGTTTCGTGGATGCCACAG

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部后，100 mA 电流条件下转膜 1 h 50 min，使用 5% CD4 Teff细胞，PBS清洗计数，以每孔3×10 个细胞的
脱脂奶粉封闭 3 h，使用 5% BSA 将兔抗人 LDHα、 量铺入96孔板中，加入200 μL RPMI 1640培养液，置
Glut1、GPI、PKM2、β ⁃ actin 按 1∶1 000 稀 释 后 ，与 于37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养24 h，10 000 r/min离
PVDF膜4 ℃摇床孵育过夜，第2天用1×TBST洗膜3 心 5 min，收集上清液，再使用糖酵解试剂盒用比色
次后，用5%脱脂奶粉溶液将辣根过氧化物酶（horse 法检测上清液中L⁃乳酸（L⁃lactate）的含量后根据标
radish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔 IgG 多克隆抗 准曲线转化为糖酵解水平。
体按 1∶5 000稀释，与PVDF膜室温摇床孵育2 h，再 1.3 统计学方法
用1×TBST洗膜3次后加ECL发光试剂A和试剂B按 在相同实验条件下，使用不同健康人的外周血
1∶1混匀后，加至PVDF膜表面，使用曝光仪进行曝光。 样本，进行 3 次独立重复实验，实验结果使用 SPSS
1.2.5 糖代谢检测 27.0软件进行处理，各组数据以均数±标准差（x ± s）
1.2.5.1 糖摄取实验 表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有
收集与 SKOV3 细胞共培养后的 CD4 Treg 和 统计学意义。
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CD4 Teff 细胞，PBS 清洗计数，以每孔 3×10 个细胞
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5
2 结 果
的量铺入 96 孔板中，加入 100 μL 无血清培养液饥
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饿细胞过夜，次日PBS洗涤细胞，加入100 μL含2% 2.1 卵巢癌细胞生长环境中 CD4 Treg 细胞糖代谢
BSA 的 KRPH 缓冲液，预孵育 40 min，再加 10 μL 的 相关基因和蛋白表达水平升高
10 mmol/L 2⁃脱氧葡萄糖（2⁃DG）孵育20 min，再经过 将扩增后的CD4 Treg细胞与卵巢癌细胞SKOV3
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NADPH产生、NADP降解以及循环放大反应后412 nm 共培养 72 h 后，RT⁃PCR 和 Western blot 检测其糖代
波长下检测吸光度值，每间隔10 min检测1次，直到 谢相关基因和蛋白的表达水平。结果显示，与
100 pmol标准孔吸光度值达 1.5~2.0，此时所有孔吸 SKOV3共培养的CD4 Treg细胞中，糖代谢相关8个
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光度值为最终值，再根据标准曲线将吸光度值换算 基因（Glut1、Glut3、HIF⁃1α、PKM2、ENO1、GPI、LDH⁃
为细胞摄取葡萄糖类似物 2⁃DG 的含量转化为糖摄 α、TPI1）的表达水平均显著高于未与SKOV3共培养
取水平。 组，差异有统计学意义，提示卵巢癌细胞生长环境
1.2.5.2 糖酵解实验 可以促进人外周血 CD4 Treg 细胞糖代谢相关基因
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收集与 SKOV3 细胞共培养后的 CD4 Treg 和 转录水平表达上调（图 1A）。同时发现在卵巢癌细
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