Page 70 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
·1000 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年7月
卵巢癌（ovarian cancer，OC）是妇科恶性肿瘤患 bit anti⁃human LDH⁃α mAb、Rabbit anti⁃human Glut1
者的首要死亡原因，2020 年统计结果显示，卵巢癌 mAb、Rabbit anti⁃human PKM2 mAb、Rabbit anti⁃hu⁃
新发病例21 750例，死亡病例达到13 940例，5年生 man GPI mAb、Rabbit anti⁃human HIF⁃1α mAb（Cell
存率不到40%，该病的发病率仅次于宫颈癌和子宫 Signaling 公司，美国）；30%丙烯酰胺、Anti⁃CD4⁃
内膜癌，占所有女性癌症的近4% 。近年来肿瘤的 FITC、Anti⁃CD25⁃APC、Anti⁃CD127⁃PE（Bio⁃Rad 公
［1］
免疫治疗成为研究热点，目前过继肿瘤浸润 T 淋巴 司，美国）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Amersham Phar⁃
细胞疗法、免疫卡控点修饰法、嵌合抗原受体T细胞 macia 公司，美国）；封闭专用脱脂奶粉（BD 公司，德
疗法、T 细胞受体疗法等免疫治疗方法已取得了一 国）；HRP 标记山羊抗兔 IgG（北京中杉金桥生物技
定进展 ［2-5］ ，但卵巢癌复杂的免疫抑制微环境是目前 术有限公司）；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂
免疫治疗的主要障碍，治疗效果仍不尽如人意。 盒（上海碧云天生物技术有限公司）。
肿瘤免疫微环境中存在着各种免疫细胞参与 1.2 方法
免疫抑制微环境的组成，包括骨髓来源的抑制性细 1.2.1 流式分选和扩增 CD4 Treg 细胞和 CD4 Teff
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胞（myeloid⁃derived suppressor cell，MDSC）、肿瘤相 细胞
关巨噬细胞（tumor⁃associated macrophage，TAM）、调 抽取50 mL正常人的外周血（EDTA抗凝），Ficoll
节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）等 ［6-9］ ，其中 Treg 液分离人外周血单个核细胞（PBMC），PBS洗涤弃上
细胞是卵巢癌免疫抑制微环境形成的重要因素。 清后，加入流式抗体 Anti⁃CD4⁃FITC 40 μL、Anti⁃
在肿瘤微环境中，癌细胞与免疫细胞会发生营养代 CD25⁃APC 50 μL、Anti⁃CD127⁃PE 30 μL，室温避光
谢的竞争，肿瘤细胞大量消耗葡萄糖导致营养缺 孵育20 min，PBS清洗后使用BD FACS Aria Ⅱ 进行
乏，肿瘤微环境中活化的 T 细胞代谢与功能受到限 分选。将分选后的细胞铺入96孔板，加入20 μL Treg
制，最终抑制T细胞的免疫监视功能，使得肿瘤进一 细胞扩增磁珠，进行细胞扩增。
步发展 ［10-11］ 。 1.2.2 CD4 Treg、CD4 Teff 细胞与 SKOV3 建立共培
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本课题组前期研究发现，卵巢癌患者外周血 养体系
CD4 T细胞与健康人相比有更高的糖摄取和糖酵解 收集扩增后的 CD4 Treg 细胞和 CD4 Teff 细胞
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水平，并且其中Treg细胞比例上升 ［12］ 。为了进一步 和生长状态良好的SKOV3细胞，PBS清洗后计数铺
明确 Treg 细胞是导致卵巢癌患者外周血 CD4 T 细 入带有 0.4 μm 孔径小室的 24 孔培养板，SKOV3 细
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胞产生这一糖代谢特征的主要因素，我们对卵巢癌 胞以 2×10 个细胞每孔铺于 Transwell 板下室，CD4 +
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细胞生长环境中的 CD4 Treg 细胞和 CD4 Teff 细胞 Treg 细胞与 CD4 Teff 细胞以 8×10 个细胞每孔分别
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的不同糖代谢特征进行探讨。 铺于 Transwell 板上室，调整终体积为 1.5 mL/孔，置
37 ℃ 、5% CO2培养箱共培养 72 h 后，收集两组 T 细
1 材料和方法
胞，进行后续实验。
1.1 材料 1.2.3 实时荧光定量PCR（RT⁃PCR）实验
新鲜外周血 50 mL 由健康志愿者自愿提供；人 收集与 SKOV3 细胞共培养前后的 CD4 Treg 细
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卵巢浆液性囊腺癌细胞株 SKOV3 来源于中科院上 胞以及与 SKOV3 细胞共培养后的 CD4 Treg、CD4 +
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海细胞库。本研究经南京医科大学第一附属医院 Teff 细胞，PBS 清洗后用 RNeasy Micro Kit 提取总
伦理委员会批准（伦审号：2017⁃SRFA⁃064）。 RNA，调整浓度为 500 ng/mL 后，37 ℃ 15 min，85 ℃
组织淋巴细胞分离液Ficoll（天津灏洋生物制品 5 s 条件下采用 PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒将
有限公司）；KRPH 缓冲液（北京雷根生物技术有限 总 RNA 逆转录为 cDNA，再用 RT⁃PCR 检测糖代谢
公司）；CD3/CD28 T 细胞扩增磁珠（Invivogen 公司， 相关基因葡萄糖转运蛋白 3（glucose transporter3，
美国）；糖摄取分析试剂盒（Biovision公司，美国）；糖 Glut3）、葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1（glucose transporter1，
酵解分析试剂盒（Cayman，美国）；RNeasy Micro Kit Glut1）、缺氧诱导因子 1α（hypoxia⁃inducible factor⁃1
（Qiagen 公司，美国）；PrimeScript RT reagent Kit（Ta⁃ alpha，HIF⁃1α）、人葡萄糖 6 磷酸异构酶（glucose⁃6⁃
KaRa 公司，日本）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（大连宝 phosphate isomerase，GPI）、烯 醇 化 酶 1（enolase1，
TM
生物工程有限公司）；PCR 引物（南京金斯瑞生物科 ENO1）、M2 型 丙 酮 酸 激 酶（M2 ⁃ pyruvate kinase，
技有限公司）；Rabbit anti⁃human β⁃actin mAb、Rab⁃ PKM2）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH⁃
