Page 78 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
               ·1008 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


              1.2.4 H9C2细胞培养与处理                                 有统计学意义。
                  将 H9C2 大鼠心肌细胞培养在含有 10%胎牛血
                                                                2  结 果
              清和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM完全培养基
              中，并置于 37 ℃，5% CO2恒温培养箱中。将细胞分                      2.1  栀子苷对1型糖尿病小鼠血糖和体重的影响
              为5组，正常对照（NC）组：细胞在含5.5 mmol/L葡萄                         与 对 照 组 相 比 ，STZ 组 血 糖 水 平 显 著 升 高
              糖的培养基中培养 54 h；高糖（HG）组：细胞在含有                       ［（17.21 ± 1.49）mmol/L vs.（4.94 ± 0.38）mmol/L，P <
              33 mmol/L 葡萄糖的培养基中培养 48 h；高糖+栀子                   0.001，图1A］；与STZ组相比，GE50组能显著降低小
              苷（NC+GE）组：在 NC 组的基础上以 100 μmol/L 的                鼠血糖［（15.13±0.84）mmol/L vs.（17.21±1.49）mmol/L，
              栀子苷处理 54 h；HG+GE 组：以 100 μmol/L 的栀子               P < 0.01，图1A］，但GE50组血糖水平仍明显高于对
              苷预处理 6 h，在含有 33 mmol/L 葡萄糖的培养基中                   照组（P < 0.001）。此外，与对照组相比，STZ组小鼠
              共同培养48 h；高糖+栀子苷+ AMPK 抑制剂化合物                      体重水平显著降低［（18.09±1.25）g vs.（24.01±1.00）
              C（HG+GE+CC）组：以 100 μmol/L 的栀子苷预处理                 g，P < 0.001. 图 1B］；与 STZ 组相比，GE25 组、GE50
              6 h，10 μmol/L 的化合物 C 预处理 30 min，在含有               组小鼠体重明显增加（P < 0.01，图1B），但仍明显低
              33 mmol/L葡萄糖的培养基中共同培养48 h。                        于对照组（P < 0.001）。
              1.2.5 CCK⁃8检测细胞活力
                  待细胞长至 80%左右，胰酶消化，细胞悬液以                               A  25
              5×10 个/mL的密度接种于6孔板中。为确定栀子苷                                  20          ***         ***
                  4
              对H9C2细胞活力的作用，以不同浓度的栀子苷（0、                                                     ***    ##
              20、40、80、100、200 μmol/L）对 H9C2 细胞干预处理                      （ mmol/L）  15
              54 h；为确定高糖对 H9C2 细胞活力的抑制作用，以                               血糖  10
              不同浓度的葡萄糖（12.5、25.0、33.0、44.0 mmol/L）对                        5
              H9C2细胞干预处理48 h；为确定栀子苷可以改善高                                   0
                                                                                Con   STZ  STZ+GE25  STZ+GE50
              糖对H9C2细胞活力的抑制作用，以不同浓度栀子苷
                                                                       B  30
             （0、20、40、80、100、200 μmol/L）+高糖（33 mmol/L）对
                                                                          25
              H9C2 细胞干预处理。按上述分组处理后，每孔加
              入 10 μL CCK⁃8 溶液，孵育 1~4 h，用酶标仪检测其                          （ g ）  20          ***   ***
                                                                                                   ##
                                                                                            ##
              在490 nm处的吸光度值，再换算成细胞存活率进行                                  体重  15       ***
                                                                          10
              比较。
                                                                           5
              1.2.6 Western blot 检测
                                                                           0
                  将心脏组织或 H9C2 细胞用 RIPA 裂解液处理                                    Con   STZ  STZ+GE25  STZ+GE50
              后提取细胞蛋白。BCA蛋白定量后，用12%和6%的                             A：各组小鼠血糖测定；B：各组小鼠体重测定。与Con 组比较，
                                                                                   ##
                                                                *** P < 0.001；与STZ 组比较，P < 0.01（n=8）。
              聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）进行电泳，转印到
                                                                    图1 栀子苷对1型糖尿病小鼠血糖和体重的影响
              PVDF 膜上。5%的脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h，4 ℃
                                                                Figure 1  The effect of geniposide on blood glucose and
              下与指定的一抗（抗 LC3B、P62、Beclin1、AMPK、p⁃
                                                                         body weight in type 1 diabetic mice
              AMPK、mTOR、p ⁃ mTOR、BAX、BCL2、Caspase3 和
              Cleaved caspase3 抗体）孵育过夜，TBST 洗涤后用辣               2.2 栀子苷能够抑制1型糖尿病小鼠的心肌纤维化
              根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，用增强型化学发                               HE染色结果表明，STZ组小鼠表现出明显的心
              光（ECL）试剂检测蛋白质条带。α⁃tublin 作为内参                     肌结构异常，包括心肌纤维断裂，细胞结构紊乱，细
              蛋白，用Image J软件分析条带灰度值。                             胞间隙增大。与 STZ 组相比，GE25 组和 GE50 组可

              1.3  统计学方法                                        以改善糖尿病引起心肌结构损伤（图 2A）。Masson
                  每组实验均为3次以上独立实验。采用Graph⁃                       染色结果表明，STZ 组小鼠心肌间质胶原沉积增加
              pad Prism 7 软件进行统计学分析，所有数据均以均                     （P < 0.01）。与STZ组相比，GE25组和GE50组可以
              值±标准差（x ± s）表示，多组均数比较采用单因素方                       明显减少胶原沉积（P < 0.01，图 2B、E）。免疫组化
              差分析，两两比较采用 LSD⁃t 检验，P < 0.05 为差异                  染色表明，与对照组相比，STZ组小鼠Collagen Ⅰ和
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