Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
               ·938 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


              ways，ECSIT）是 Toll 样受体/白介素⁃1 受体（Toll⁃like          游信号通路的改变。目前，通过干预ECSIT 3′⁃UTR
              receptors/interleukin⁃1 receptor，TLRs/IL⁃1R）信号通   从而调节 ECSIT 的表达尚无文献报道。因此，本研
              路中高度保守的信号分子，在先天免疫、胚胎发育                            究使用 3′RACE 技术克隆得到 ECSIT 3′⁃UTR 的序
              和线粒体相关功能中发挥重要作用                  ［5-7］ 。Toll 样受   列，并观察 miRNA 和 siRNA 对细胞中 ECSIT 表达的
              体识别病原体相关分子模式并通过转化生长因子                             影响，以验证调控 ECSIT mRNA 翻译表达的序列区
              激酶1（TGF beta⁃activated kinase 1，TAK1）或有丝分         域，为后续从分子水平探明 ECSIT 的作用机制及其
              裂原/细胞外信号调节激酶激酶 1（mitogen/extracel⁃                在心血管疾病等防治方面的开发应用奠定良好的
              lular signal⁃regulated kinase kinase 1，MEKK⁃1）激活  理论基础。
              NF⁃κB和AP⁃1转录因子的表达，促进炎症信号的激
                                                                1  材料和方法
              活，肿瘤坏死因子受体相关因子 6（tumor necrosis
              factor receptor⁃associated factor 6，TRAF6）是这两个    1.1  材料
              级 联 下 游 信 号 分 子 。 在 应 激 条 件 下 ，ECSIT 与                 C57BL/6J 小鼠为 SPF 级（购自南京医科大学医
              TRAF6结合，参与 NF⁃κB 信号与 MEKK⁃1 的信号通                  药实验动物基地并饲养于此基地），研究经南京医
              路调控    ［5］ 。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic            科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：IACUC

              protein，BMP）是转化生长因子β（transforming growth          2008005）。
              factor β，TGF⁃β）超家族的成员。在 BMP 通路中，                       反转录试剂盒 PrimerScript     TM  RT、pMD⁃18T 载
              ECSIT 可以作为 Smad1 和 Smad4 的辅助因子，并与                 体、DL1000 Marker（TaKaRa 公司，日本）；氨苄青霉
              特定BMP靶基因（如Tlx2）的启动子结合，在小鼠的                        素（上海生光公司）；凝胶回收试剂盒、大肠杆菌
              胚胎发育过程中起关键作用，且 ECSIT 敲除小鼠具                        DH5α感受态细胞（北京天根生化）；Taq 酶（NEB 公
                           ［6］                                                        TM
              有胚胎致死性 。此外，ECIST 与分子伴侣 NDU⁃                       司，美国）；Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen
              FAF1 相互作用并参与线粒体复合物Ⅰ的组装，沉                          公司，美国）；ECSIT 抗体（Abcam 公司，美国）；GAP⁃
              默 ECSIT 的表达可导致线粒体复合物Ⅰ组装严重                         DH抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG
                                          ［7］
              损伤，进而导致线粒体功能紊乱 。已有研究报道，                           （上海碧云天生物有限公司）；DMEM 细胞培养基
              ECSIT在成年小鼠骨骼肌、肝脏、肾脏和心脏中均有                         （Gibco 公司，美国）；胎牛血清（BI 公司，以色列）。
              表达 。但是，ECSIT 的表达受哪些因素调控，尤其                        PCR 仪、mini PROTEAN 3cell 电泳仪（Bio⁃Rad 公司，
                  ［5］
              是在翻译水平上的调控尚不清楚。                                   美国）；SSC⁃24P 空气恒温摇床（江苏太仓实验设备
                  在真核生物中，长为 20~30 个核苷酸的非编码                      厂）；AE⁃100电子分析天平（METTLER公司，瑞士）；
              RNA 分子已成为基因组表达和功能的关键调控因                           台式离心机（Heraeus公司，德国）。
              子，根据其作用模式不同，其主要被分为两类，即微小                               根据 NCBI 数据库里的小鼠 ECSIT 基因序列设
              RNA（microRNA，miRNA）和小干扰 RNA（siRNA） 。              计合成引物，测序由上海英骏生物技术有限公司完
                                                         ［8］
              miRNA是一类由内源基因编码的长度为20~24个核                        成。引物序列为3′Adaptor：5′⁃GCTGTCAACGATAC⁃
              苷酸的非编码单链RNA，可在多种生物过程中调控                           GCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTT ⁃
              基因表达，包括发育、细胞分化、脂肪代谢和生长控                           TTTTT⁃3′，3′Adaptor MN：5′⁃GCTGTCAACGATAC⁃
                ［9］
              制 。转录后基因表达的抑制方法包括抑制翻译和                            GCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTT ⁃
              mRNA 的剪切，miRNA 可直接与靶mRNA 的3′⁃UTR                  TTTMN⁃3′，3′musECSIT⁃F：5′⁃ATGAGTTTGACGTG⁃
              序列互补结合，通过去烯化作用对靶mRNA 进行非                          GATGAA⁃3′，3′Nested⁃primer：5′⁃CGCTACGTAACG⁃
              切割降解，起到翻译抑制作用                 ［10- 11］ 。RNA 干扰    GCATGACAGTG⁃3′。
             （RNA interference，RNAi）是一种内源性 RNA 干扰               1.2  方法
              途径，通过精确调控基因表达，为调控细胞信号通                            1.2.1 3′RACE实验
              路提供了强大的机制，作为 RNAi 复合物的一个组                              使用 TRIzol 法提取小鼠总 RNA，再参照 Prime⁃
              成部分，siRNA 能够沉默具有互补序列的特定基因                         Script RT 试剂盒说明书方法将 RNA 逆转录为 cD⁃
                                                                     TM
              的表达   ［12］ 。ECSIT mRNA 的 3′⁃UTR 作为其 mRNA          NA。具体步骤为：①去除基因组 DNA。5 × gDNA
              的重要组成部分，可能与 miRNA 或 siRNA 结合，引                    Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA
              导 ECSIT mRNA 发生翻译受阻或降解，从而引起下                      （1 000 ng），RNase Free dH2O 补齐，42 ℃ 2 min。②
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