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第41卷第7期               周小蓉，陆 霞，李建涛，等. 成年小鼠ECSIT 3′⁃UTR的鉴定及功能分析［J］.
                  2021年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：937-942                       ·939 ·


                                                                                 TM
                反 转 录 。 PrimeScriptRT Enzyme Mix I 2 μL，5 ×       用 Lipofectamine 2000，按 照 说 明 将 50 nmol/L 的
                PrimeScript Buffer（for real time）4 μL，步骤①的反应      siRNA 和 miRNA 转染至 RAW264.7 细胞和 Hepa1⁃6
                液 10 μL，3′Adaptor、3′Adaptor MN 各 1 μL，RNase       细胞，4 h 后换完全培养基，培养 36 h 后进行下一步
                Free dH2O 3 μL，反应条件为42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，         实验。
                4 ℃保存。③PCR及其产物鉴定回收。使用逆转录                          1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）
                产物 cDNA 为模板，以 musECSIT F 作为外侧上游引                      提取细胞总蛋白并使用BCA法测定其浓度，加
                物，3′Nested⁃Primer 为下游引物和 Taq 酶进行套式                5×加样缓冲液后 99 ℃煮 5 min 使蛋白变性，再进行

                PCR扩增。反应条件如下：95 ℃预变性2 min，95 ℃                    聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后使用湿转法将蛋
                变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；               白转移至 PVDF 膜上，将膜置于 TBS⁃T 配制的 5%脱
                72 ℃延伸 10 min。反应结束后经琼脂糖凝胶电泳                       脂奶粉溶液中，室温封闭 1 h，TBS⁃T 清洗膜 3 次，加
                检测结果。                                             入一抗置于4 ℃摇床孵育过夜，次日回收一抗，TBS⁃
                1.2.2 目的片段T载体克隆及序列分析                              T清洗膜3次，二抗室温孵育1.5 h，清洗膜3次后，使

                    3′RACE 扩增条带切胶回收，连接于 pMD18⁃T                   用ECL显色液曝片，采用Image Lab图像分析软件进
                载体（具体操作参照产品说明书），转化大肠杆菌                            行灰度分析。
                DH5α感受态，菌落 PCR 鉴定的阳性克隆样品送测                        1.3  统计学方法
                序。经过以上步骤，获得ECSIT 3′下游未知序列，将                           应用GraphPad Prism5软件统计数据，计量数据
                碱基序列提交到NCBI数据库做BLAST比对。                           用均数±标准差（x ± s）表示。使用单因素方差分析
                1.2.3 miRNA和siRNA的设计和合成                          （one⁃way ANOVA）方法分析组间变异度，组内的两
                    使用 TargetScan 软件预测 ECSIT 基因潜在结合               两比较采用 Tukey 检验。P < 0.05 为差异有统计学
                的 miRNA，其 中 miR ⁃ 7 ⁃ 5p（序 列 为 3′ ⁃ UGUU⁃         意义。
                GUUUUAGUGAUCAGAAGGU⁃5′）和miR⁃296⁃5p（序
                                                                  2  结 果
                列 3′⁃UGUCCUAACUCCCCCCCGGGU⁃5′）预测可能
                与ECSIT 3′⁃UTR的序列结合，因此将2种miRNA序                    2.1  ECSIT mRNA 3′⁃UTR的鉴定及测序
                列交由广州锐博生物技术有限公司合成。根据 3′                               ECSIT 的 3′RACE⁃PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶
                RACE 实验结果及 NCBI 数据库中 ECSIT 的序列设                   电泳检测可见阳性条带（图1A），凝胶回收扩增的片
                计4个干扰不同序列的siRNA，它们干扰ECSIT靶基                       段，克隆于pMD⁃18T载体，转化大肠杆菌DH5α感受
                因段为 siRNA1：5′⁃GCCACGTGGACTTCATCTA⁃3′，             态，菌落PCR鉴定阳性克隆（图1B），测序结果显示有
                位于第 601~619 个碱基；siRNA2：5′⁃GCCTGATCT⁃              效序列的长度为346 bp（图1C）。将序列与NCBI数据
                CAGTGCTAAA⁃3′，位于第 992~1 009 个碱基；siR⁃              库中ECSIT的mRNA序列进行比对，一致率达到99%。
                NA3：5′⁃GGAAGATGATGAGGCCATT⁃3′ ，位 于 第              2.2  miR⁃7⁃5p调节小鼠细胞中ECSIT蛋白的表达
                1 547~1 565 个碱基；siRNA4：5′⁃GTAATAAGTGC⁃                图 2A 为预测软件识别的 ECSIT 与 miRNA 的互
                GTCTATTA⁃3′，位于第 1 547~1 565 个碱基，siRNA             补序列。Western blot 结果发现，与 NC 组相比，He⁃
                均交由广州锐博生物技术有限公司设计并合成。                             pa1⁃6细胞转染miR⁃7⁃5p可以明显抑制 ECSIT 的蛋
                1.2.4 细胞培养                                        白表达（P < 0.05，n=3），而转染miR⁃296⁃5p对ECSIT
                    从液氮中取出RAW264.7细胞和Hepa1⁃6细胞，                   的表达没有明显影响（P > 0.05，图 2B），并且在
                迅速在37 ℃水浴锅中摇晃，融化后转移至预先装好                          RAW264.7 中观察到相同的变化趋势（P < 0.01，图
                培养基的离心管内，500 r/min 4 ℃离心 5 min，弃上                 2C）。以上结果提示miR⁃7⁃5p可能是ECSIT的潜在
                清，加入含有10%血清的DMEM 培养基进行重悬后                         调节因子。
                种板，置于细胞培养箱中培养。当细胞铺满皿底                             2.3  siRNA干扰小鼠细胞系中ECSIT蛋白的表达
                80%~90%时，进行传代，每48 h换1次完全培养基。                          Western blot结果显示，与NC组相比，在Hepa1⁃
                1.2.5 miRNA和siRNA转染                               6 细胞中转染 siRNA 1、2 后 ECSIT 的表达显著下降
                    将 siRNA 和 miRNA 配成浓度为 20 μmol/L 的储           （P < 0.01，n=3），但siRNA 3、4对其表达没有明显影
                液，并分装冻存于-80 ℃冰箱。密度为30%~50%的                       响（P > 0.05，图3A）；此外，在RAW264.7中观察到相
                细胞换新鲜无血清和不含双抗的DMEM培养基，使                           同的变化趋势（P < 0.05，图3B）。
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