Page 14 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
               ·944 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


              加、血管生成和黏液腺的增加为其主要特征 。当                            （上海碧云天生物技术有限公司）。
                                                      ［4］
              前，临床上尚无有效方法治愈哮喘。因此，重要的是                           1.2  方法
              探索气道炎症和重塑的机制，并寻求新的策略。                             1.2.1 细胞培养
                  同源异型盒基因 1（sine oculis homeobox homo⁃               HEK⁃293 和 BEAS⁃2B 细胞在含有 10%胎牛血
              log 1，Six1）是一种包含同源结构域的转录因子，对                      清的 DMEM 高糖培养基中培养，并置于 37 ℃、5%
              细胞增殖、迁移、侵袭和上皮⁃间充质转化（epithe⁃                       CO2培养箱，2~3 d 传代 1 次。实验操作均采用对数
              lial⁃mesenchymal transition，EMT）起着重要作用    ［5-7］ 。  期生长细胞。
              Six1表达在胚胎发生后大幅度下调，但在许多癌症中                         1.2.2  人 Six1 启动子荧光素酶报告基因重组质粒
              重新高表达，从而有助于肿瘤的生长                ［8-9］ 。在哮喘中，      的构建与鉴定
              Six1对转化生长因子β（transforming growth factor⁃β，             人 Six1 基因序列（GenBank 编号：NC⁃000014.9）
              TGF⁃β）1 介导的 EMT、气道炎症及气道重塑具有重                      从美国国立生物技术中心数据库 NCBI（http：//www.
              要作用   ［10］ 。气道炎症和重塑是哮喘两个最典型的病                     ncbi.nlm.nih.gov/gene/）找到起始密码子ATG 上游约
              理特征，渗透到气道的炎症细胞通过促进气道平滑肌                           351 bp 片段序列。将人 Six1 启动子的转录起始位
              细胞的增殖和迁移而有助于气道重塑。                                 点（TSS）设置为+1。将人Six1 DNA片段-351~100 nt
                  因此，研究人Six1基因对哮喘、肿瘤等疾病有重                       的启动子插入 pGL3⁃Basic 载体中，命名为 pSix1⁃
              要的理论指导意义。但是目前对Six1的研究主要集                          451。用 JASPAR 软件（http：//jaspar.genereg.net/）预
              中在信号通路及其与蛋白的相互作用上，对于Six1自                         测转录因子结合位点。
              身的转录调控机制研究较少。本实验通过构建人                             1.2.3 脂质体转染细胞
              Six1 启动子荧光素酶报告重组质粒，通过瞬时转染                              将 HEK⁃293 和 BEAS⁃2B 细胞分别接种到 96 孔
              HEK⁃293细胞和BEAS⁃2B细胞，分析其在这2种细胞                     板 中（1 × 10 个/孔）。 24 h 后 ，使 用 Lipofectamine
                                                                           4
              中的荧光素酶活性，接着通过qRT⁃PCR和蛋白质免疫                        3000 将 100 ng 启动子报告质粒 pSix1⁃451 或 pGL3⁃
              印迹实验测定敲低、过表达E2F转录因子4（E2F tran⁃                    Basic 与pRL⁃TK 质粒（4 ng）一起共转染到细胞中作
              scription factor 4，E2F4）后Six1表达量的改变，旨在为           为内部对照。使用Lipofectamine 3000试剂将100 ng
              进一步研究人Six1基因的转录调控机制奠定基础。                          启动子报告质粒 pSix1⁃451 与 siE2F4（50 nmol/L）或
                                                                siNC（50 nmol/L）瞬时转染到细胞中，于 37 ℃、5%
              1  材料和方法
                                                                CO2培养箱培养24 h，观察敲低E2F4对pSix1⁃451启
              1.1  材料                                           动活性的影响；另外，将pSix1⁃451与pENTER⁃E2F4
                  人胚肾细胞（HEK⁃293）、人肺支气管上皮细胞                      （100 ng）或pENTER（100 ng）进行共转染，观察过表
             （BEAS⁃2B）、pGL3⁃basic 质粒、pRL⁃TK（海肾荧光素               达E2F4对pSix1⁃451启动活性的影响。
              酶报告质粒）为本实验室保存；E2F4 小干扰 RNA                        1.2.4 双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性
              siE2F4 及其阴性对照 siNC、E2F4 过表达质粒 pEN⁃                     弃培养基，用 100 μL/孔磷酸盐缓冲液（phos⁃
              TER⁃E2F4及空载体pENTER（南京擎科生物科技有                      phate buffer saline，PBS）将 96 孔板清洗 2~3 遍，每孔
              限公司）；DMEM 培养基（ThermoScientific 公司，美               加入 30 μL 裂解液后室温震荡 20 min，按照双荧光
              国）；胎牛血清（Gibco公司，美国）；青链霉素双抗（上                      素酶检测试剂盒步骤测定pGL3⁃basic、pSix1⁃451以
              海碧云天生物技术有限公司）；小量质粒抽提试剂盒                           及敲低和过表达E2F4后pSix1⁃451的启动子活性，并
             （Omega公司，美国）；DNA Marker、限制性内切酶MIU                  将其标准化为pRL⁃TK的活性。结果至少重复3次。
              Ⅰ和 XhoⅠ、T4 DNA 连接酶和逆转录酶（TaKaRa 公                  1.2.5 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）
              司，日本）；SYBR Green qPCR Master Mix（Bimake 公              使用 TRIzol 试剂从细胞系中提取总 RNA，然后
              司，美国）。质粒转染试剂Lipofectamine3000脂质体                  使用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit

             （Invitrogen公司，美国）；双荧光素酶检测试剂盒（Pro⁃                  将其反转录为第一链 cDNA。qRT⁃PCR 使用 SYBR
              mega公司，美国）；琼脂糖（GENE公司，西班牙）；总蛋                     Green 技术在 LightCycler480Ⅱ（罗氏公司，美国）中
              白提取试剂盒（南京凯基生物技术股份有限公司）；                           进行。反应条件为：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s，
              E2F4、Six1、GAPDH 一抗（Proteintech 公司，美国）；            60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环，最后 72 ℃延伸
              SDS⁃PAG 凝胶、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗                         5 min。所有样品均以β⁃actin 作为标准品进行 3 次
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