Page 19 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第7期 南京医科大学学报（自然科学版）
2021年7月 Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences） ·949 ·

·基础医学·

利用双引导RNA的CRISPR/Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠

朱浩然 ，张 鑫 ，祁俊侠 ，闫丽红 ，赖娅娜 ，李聚学 1*
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南京医科大学生物化学与分子生物学系，医药实验动物中心，江苏 南京 211166
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［摘 要］ 目的：利用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术构建 Nudix 水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分 X 基序 3［Nudix
（nucleotide diphosphate linked moiety X）⁃type motif 3，Nudt3］基因敲除C57BL/6小鼠模型。方法：根据CRISPR/Cas9介导的基因
编辑技术，在 Nudt3 基因第 2 个外显子位置及第 2 个外显子与第 3 个外显子间的区域分别设计 2 个引导 RNA（guide RNA，
gRNA），结合早期胚胎显微注射技术构建生殖系基因编辑嵌合体小鼠，并从中筛选出合适的基因敲除小鼠。在此基础上，采用
反转录PCR（reverse transcription PCR，RT⁃PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）技术验证Nudt3基因在mRNA 和蛋白水平的
表达。结果：以较高效率获得了 F0 代基因编辑小鼠，通过繁育获得了 F1 代杂合子小鼠和 F2 代纯合子小鼠。RT⁃PCR 和
Western blot检测结果显示，F2代纯合子小鼠的若干代谢调控组织（如肝脏、下丘脑等）中均无Nudt3基因表达。结论：Nudt3基
因敲除小鼠构建成功，为下一步的代谢表型鉴定以及机制研究提供了理想的动物模型。
［关键词］ CRISPR/Cas9；NUDT3；肥胖；基因敲除
［中图分类号］ Q785 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2021）07⁃949⁃07
doi：10.7655/NYDXBNS20210703

Construction and validation of Nudt3⁃knockout mice using CRISPR/Cas9 technique with
double⁃guided RNA
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ZHU Haoran ，ZHANG Xin ，QI Junxia ，YAN Lihong ，LAI Yana ，LI Juxue 1*
Department of Biochemistry & Molecular Biology，Animal Core Facility，Nanjing Medical University，Nanjing
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211166，China
［Abstract］ Objective：This study aims to establish Nudt3 knockout mouse model. Methods：According to the principle of CRISPR/
Cas9⁃mediated gene editing technology，two gRNAs were separately designed at the exon 2 and the region between the exon 2 and the
exon 3 of the Nudt3，and germline chimeric mice were constructed by microinjection of early embryos，from which suitable gene
knockout mice were screened. RT⁃PCR and Western blot were used to verify the expression of Nudt3 at mRNA and protein levels.
Results：We obtained gene editing mice of F0 generation with high efficiency，heterozygous mice of F1 generation and homozygous
mice of F2 generation through breeding. The Western blot results showed that there was no expression of NUDT3 in several metabolic
regulatory tissues of F2 generation homozygous mice. Conclusion：Nudt3⁃knockout mice are successfully constructed，this provides an
ideal animal model for further metabolic phenotype analysis and mechanism study.
［Key words］ CRISPR/Cas9；NUDT3；obesity；gene knockout
［J Nanjing Med Univ，2021，41（07）：949⁃955］

Nudix 水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分 X）⁃type motif 3，NUDT3］属于 Nudix 水解酶家族成

X 基序 3［Nudix（nucleotide diphosphate linked moiety 员，参与多种代谢调控过程 ［1-3］ ，目前已知该家族共有
21个成员 ，该家庭中的许多成员在代谢调控方面
［4］
有重要作用。但是，NUDT3在肥胖发生和发展中的
［基金项目］ 国家自然科学基金（82070872，92049118）
通信作者（Corresponding author），E⁃mail：laiyana@njmu.edu.cn，
∗ 作用尚不清楚。一项关于日本肥胖人群的全基因
lijuxue@njmu.edu.cn 组关联分析（genome⁃wide associaotion study，GWAS）