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第41卷第7期       朱浩然，张     鑫，祁俊侠，等. 利用双引导RNA的CRISPR/Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠［J］.
                  2021年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：949-955                       ·951 ·


                1.2.3 基因敲除脱靶位点预测与脱靶效应检测                           1.2.6  Western blot 检测 Nudt3 小鼠各组织蛋白水
                                                                                             -/-
                    利 用 在 线 软 件 https：//cm.jefferson.edu/Off ⁃    平的表达
                Spotter/进行脱靶位点预测，筛选出与 gRNA 序列同                        脱臼法处死 F2 代纯合 Nudt3 基因敲除小鼠和
                源性较高的脱靶位点，随后在美国国家生物技术信                            对照组野生型小鼠，依次取各部分组织，加预冷的适
                息 中 心 （National       Center  for  Biotechnology  量蛋白裂解液（内含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。用组
                Information，NCBI）的 C57BL/6 小鼠基因组（https：//         织匀浆机将组织充分研磨后，冰浴 1 h，13 000 r/min
                www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/genome/?  4 ℃离心 30 min，取上清。用 BCA 试剂盒测定组织
                id=GCF_000001635.27，物种 taxid：10090）中找到该           蛋白质浓度，并按照测定的浓度适当稀释蛋白质样
                位点附近的核酸序列，设计测序引物（表 2）以测定                          品。加入蛋白上样缓冲液混合，95 ℃煮沸 5 min
                预测脱靶位点的基因组。                                       后，-20 ℃ 保存。取 40 μg 蛋白样本进行 10% SDS⁃
                                                                  PAGE 凝胶电泳，转膜，5% 脱脂奶粉溶液封闭 1 h，
                         表2 脱靶预测位点测序引物序列                          加入一抗（兔抗小鼠 NUDT3，鼠抗小鼠 GAPDH，
                Table 2  The primer sequences for the predicted off ⁃  均 1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜，次日 TBST 洗涤
                        target site sequences
                                                                  3 次，每次 5 min，加入山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗
                  预测位点                  引物序列（5′→3′）
                                                                 （1∶1 000 稀释）室温孵育 1 h，TBST 洗涤 5 min，共
                  gRNA⁃1⁃A       F：TAATGGACTGCATGACCCACC
                                                                  洗 3 次 。根据ECL说明书显影，使用凝胶成像系统
                                 R：TTACAGTGCGGTCTGTGTGA
                                                                  拍照。
                  gRNA⁃1⁃B       F：CAGCGTGGACTCAGGTAAGC
                                                                  1.3  统计学方法
                                 R：GGTACTCTGGATCAGCGTTGT
                                                                      采用 GraphPad Prism 9.0、SPSS22.0 软件进行统
                  gRNA⁃2⁃A       F：ACGTCGTCTCCATGCCAGAG
                                 R：GGGGTGAGAGAATCGAGCTG           计学分析，数据以均数±标准误（x ± sx ）表示，两组间
                  gRNA⁃2⁃B       F：CAGCCCTGTGGCATGATCTC           比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                                 R：AGGTTTTGTGGGCAGACCAAG
                                                                  2  结 果

                1.2.4  实 时 荧 光 定 量 PCR（quantitative real ⁃ time   2.1  Nudt3基因在各组织中的表达以及在高脂饲料
                PCR，qPCR）检测小鼠Nudt3基因mRNA表达                        饲喂下的表达变化
                    采 用 TRIzol 法 提 取 组 织 总 RNA，根 据                    用定量 PCR 检测 Nudt3 基因的 mRNA 表达谱，
                PrimeScript TM  RT Reagent Kit 逆转录试剂盒说明制          结果显示，Nudt3在中枢神经系统高表达（图1A）。
                备 cDNA 样品。按如下步骤进行qPCR，反应体系如                           为了进一步探究NUDT3与代谢的关系，我们检
                下（20 μL）：2×SYBR Green MasterMix 10 μL、cDNA        测了在 60%高脂饲料诱导下 Nudt3 基因表达的变
                模板 2 μL、上游引物 0.8 μL、下游引物 0.8 μL、无菌                化。结果显示，在高脂饲料的诱导下，下丘脑、肾、
                水 6.4 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，1 个循环；95 ℃               肝的Nudt3基因表达显著下调，白色脂肪、棕色脂肪
                10 min，1 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。         中Nudt3基因表达显著上调（P＜0.05，图1B）。从这
                每个样品均做 3 个重复反应，以 Actb 为内参基因                       些结果中可以看出，Nudt3 基因在重要代谢调控组

                根据公式 2    -ΔΔCT 计算 Nudt3 mRNA 在各组织中的表             织中的表达会受到高脂饲料诱导的调控，提示
                达量。                                               NUDT3在能量代谢中可能发挥重要作用。
                1.2.5 PCR检测Nudt3 小鼠Nudt3基因mRNA表达                  2.2  针对Nudt3基因的gRNA序列设计
                                    -/-
                    按上述方法提取组织总 RNA 并制备 cDNA 样                         为了进一步研究Nudt3基因在能量调控中的作
                品。按如下步骤进行PCR。反应体系如下（20 μL）：                       用机制，我们拟利用 CRISPR/Cas9 技术构建 Nudt3
                2 × Taq Plus MasterMix 10 μL、cDNA 模板 3 μL、上       基因敲除小鼠。使用CRISPR/Cas9 技术进行基因敲
                游引物 0.8 μL、下游引物 0.8 μL、无菌水 5.4 μL。                除时，合理的gRNA设计十分重要。根据经验，一般
                反应条件：50 ℃ 2 min，1 个循环；95 ℃ 10 min，1 个             将 gRNA 设计在目的基因编码区域的 2 号外显子
                循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。PCR 产             （Exon 2），或编码区域的前 1/3 处，在此区域切割使
                物进行琼脂糖凝胶电泳，分析检测 mRNA 的表达                          DNA 双 链 断 裂 ，通 过 非 同 源 性 末 端 结 合（non ⁃
                情况。                                               homologous end joining，NHEJ）修 复 ，产 生 移 码 突
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