Page 20 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
·950 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年7月
发 现 ，单 核 苷 酸 多 态 性（single nucleotide 药实验动物中心完成［实验动物生产许可证号：
polymorphism，SNP）rs206936 位点与肥胖密切相关， SYXK（苏）2015⁃0015］。所有实验小鼠均饲养于无
且 NUDT3 基因位于该 SNP 位点附近 。在果蝇上 特定病原体（specific pathogen free，SPF）屏障设施
［5］
［6］
敲降Nudt3基因，导致果蝇的体重显著改变 。另外 中，7：00—19：00 提供光照（光/暗循环 12 h），温度
一项研究显示，NUDT3 与女性体脂率增加有关，而 （22±3）℃，饲料与饮水随意采食，全部动物实验均严
［5］
与男性体脂率无关 。NUDT3导致的脂肪积累可能 格按照南京医科大学动物实验福利伦理审查委员
与 PI3K⁃AKT 信号有关 ［7- 8］ 。我们前期研究发现， 会（IACUC⁃1811031）批准的程序开展。
Nudt3基因在小鼠下丘脑的弓状核中有较高的表达 1.1.2 主要试剂
水平，推测其可能在下丘脑介导的能量调控中发挥 2×Taq Plus MasterMix、2×SYBR Green MasterMix
重要作用。然而，目前尚缺乏可进行相关研究的 （南京诺唯赞生物科技有限公司）；TRIzol（北京宝日
Nudt3 基因敲除小鼠。鉴于此，我们利用 CRISPR/ 医生物技术有限公司）；蛋白酶 K、RIPA 蛋白裂解
Cas9技术进行Nudt3基因编辑小鼠的构建 ［9-11］ 。 液、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）电
按照 CRISPR/Cas9 的技术原理，我们设计了相 泳上样缓冲液（上海翊圣生物科技有限公司）；DNA
应的引导 RNA（guide RNA，gRNA），在南京医科大 Maker DL2000（北京天根生化科技有限公司）；蛋白
学实验动物中心进行了gRNA和Cas9 mRNA的胚胎 酶和磷酸酶抑制剂（MCE 公司，美国）；二辛可宁酸
显微注射，并获得了小鼠。小鼠的基因测序结果显 （bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、
示，在 Nudt3 基因第 2 个外显子有一段 98 bp 长度的 Kinase⁃ BeyoECL Plus 超敏ECL化学发光试剂盒、鼠
序列缺失；Western blot结果也显示，Nudt3基因在多 抗小鼠 GAPDH 抗体（上海碧云天生物技术有限公
个组织（如肝脏、下丘脑等）中均不表达，表明基因 司）；兔抗小鼠NUDT3抗体（武汉三鹰生物技术有限
敲除小鼠构建成功，可为我们后续肥胖机制研究提 公司）；聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）
供理想的动物模型。 膜（Millipore 公司，美国）。Nudt3 基因敲除小鼠
DNA 鉴定引物序列信息及 RT⁃ PCR 引物序列见表
1 材料和方法
1，所有引物合成以及测序结果均来自南京擎科生
1.1 材料 物技术有限公司。
1.1.1 实验动物 1.2 方法
CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 Nudt3 基因敲 1.2.1 基因编辑小鼠的构建
除小鼠的设计和胚胎注射工作由南京医科大学医 在 C57BL/6 小鼠 Nudt3 基因的第 2 个外显子上
表1 小鼠DNA鉴定及RT⁃PCR引物序列
Table 1 The primer sequences for mice genotyping and RT⁃PCR
引物名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′）
Nudt3⁃基因鉴定引物 CAGGCGCTACCCTGTAAAGTTATT ACGTGGCTCTTGCACATGCT
Nudt3⁃表达检测引物 CTGAGGAGGAGCCAAGTGTG GATGTTCACCGAGTCCTCCC
Nudt3⁃RT检测引物 TGATGAAGCTCAAGTCGAACCA CAACTAGTCTTCCCAGTGTCCC
Actb⁃表达检测引物 GTACCACCATGTACCCAG AACGCAGCTCAGTAACAGTC
选择 gRNA 靶点，设计 2 条 gRNA，分别是 gRNA⁃1： 鼠，并对 F2 代小鼠进行基因突变分析。对 F2 代中
5′ ⁃ GTAGCCGCCATCCAGACCGA ⁃ 3′ ，gRNA ⁃ 2：5′ ⁃ 纯合小鼠进行配繁，获得基因纯合敲除小鼠品系。
GTTCTCAGTTACATTGCGGA⁃3′。合成相应的gRNA 1.2.2 基因敲除小鼠的筛选
后，对收集到的受精卵进行显微注射（Cas9 mRNA 注 提取鼠尾基因组 DNA，通过 PCR 检测目的片
射浓度为20 ng/μL，gRNA注射浓度为50 ng/μL），得到 段。反应体系：2×Taq Plus MasterMix 10 μL、上游引
的胚胎分别移植到假孕小鼠中，经过正常妊娠分娩 物 0.8 μL、下游引物 0.8 μL、DNA 模板 2 μL、无菌
后，得到 F0 代小鼠，并进行基因突变分析。将 F0 水 6.4 μL。反应条件：95 ℃ 变性 5 min；95 ℃ 30 s、
代基因突变小鼠与野生型小鼠交配获得后代 F1，并 60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循环 35 次；72 ℃ 延伸 10 min。
对 F1 代小鼠进行基因突变分析。选择发生基因移 根据 PCR 扩增数据进行测序分析，选择非 3 的倍数
码突变的 F1 代杂合雌鼠和雄鼠交配获得 F2 代小 缺失碱基的个体作为突变的阳性小鼠。
