Page 22 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第7期
·952 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年7月

A mRNA归一化 ） 1.8 B mRNA归一化 ） 1.2 * NCD
1.6
mRNA相对表达量 1.4 Nudt3 mRNA相对表达量 0.8 * HFD
1.0
1.2
1.0
0.6
0.8
Nudt （ 使用下丘脑Nudt3 0.6 （ 使用下丘脑Nudt3 0.4 ** * *
0.4
0.2
0.2
0
肝
棕色脂肪
下丘脑 中脑 小脑 海马 丘脑 嗅球 脑桥 皮层 心脏 肌肉 肾 白色脂肪 0 下丘脑 肾 肝 白色脂肪 棕色脂肪
A：Nudt3 mRNA 在各组织中的转录水平（n=3）；B：正常饲料（NCD）和高脂饲料（HFD）喂养后 Nudt3 mRNA 在不同组织中的转录水平（n=
3）；两组比较，P < 0.05，P < 0.01。
∗∗
∗
图1 Nudt3 mRNA的转录水平
Figure 1 The relative expression of Nudt3 mRNA
变。本研究将 2 条 gRNA 分别设计在 Nudt3 基因 引物，经PCR扩增测序，鉴定出3种基因型，分别为：
Exon 2（gRNA1）与Exon 2和Exon 3间的区域（gRNA2） ①Nudt3⁃KO1：394 bp碱基片段缺失，末端碱基G突变
（图 2），使用在线设计软件（http：//crispr.mit.edu/）进 为C；②Nudt3⁃KO2：在2号外显子区域出现4 bp碱基
行设计。序列分别为 gRNA⁃1：5′⁃GTAGCCGCCA⁃ 片段缺失；③Nudt3⁃KO3：383 bp 碱基片段缺失（图
TCCAGACCGA⁃3′，gRNA⁃2：5′⁃GTTCTCAGTTACAT⁃ 2）。后续实验选取敲除片段最多（394 bp 的序列缺
TGCGGA⁃3′。 失）且突变位点靠近5′端的Nudt3⁃KO1小鼠进行鉴定，
2.3 Nudt3基因敲除小鼠的测序鉴定结果 发现在Nudt3基因蛋白编码区出现98 bp碱基缺失。
合成相应的gRNA后，对116枚受精卵进行显微 使用该基因型（Nudt3⁃KO1）F1代杂合小鼠进行
注射，随后将得到的 112 枚胚胎分别移植到 5 只假 交配，建立稳定的 Nudt3 基因敲除小鼠品系。根据
孕小鼠中，经过正常妊娠分娩后，共获得17只 F0 代 我们设计的引物，基因型鉴定标准为：电泳结果只
小鼠，DNA测序鉴定结果显示14只小鼠均为敲除嵌 出现 672 bp 条带的样本为野生型，电泳结果同时出
合体。 现672 bp和279 bp 条带的样本为杂合子，电泳结果
获 得 F0 代 嵌 合 体 小 鼠 后 ，将 F0 代 小 鼠 与 只出现 279 bp 条带的样本为敲除鼠（图3A、B）。
C57BL/6 野生型小鼠杂交配繁，获取 F1 代杂合小 2.4 Nudt3基因敲除小鼠的预测脱靶位点检测
鼠。针对Nudt3基因的敲除靶点两端设计PCR鉴定 由于 gRNA 可能会有一定的脱靶效应，与基因

Nudt3 locus gRNA1
gRNA2
Exon2 26，619...26，729
Exon2
26，619...26，660 26，998...27，046
gRNA⁃1 PAM gRNA⁃2 PAM

CRISPR/Cas9

Nudt3⁃KO1

Nudt3⁃KO2

Nudt3⁃KO3
图2 Nudt3基因敲除小鼠的CRISPR/Cas9 gRNA靶点设计示意图
Figure 2 The design of CRISPR/Cas9 gRNA for the generation of Nudt3⁃knockout mice