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第41卷第7期魏莹莹，胡翔宇，祖丽皮耶·艾尔肯，等. miR⁃16/15a 小鼠NK细胞功能及其对结肠癌移植瘤
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2021年7月敏感度分析［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：956-962 ·957 ·

因复合体定位于人类基因组 13q14，该位点基因的 γ抗体（XMG12）（BioLegend公司，美国）；PE⁃CD107a
突变与慢性淋巴细胞性白血病以及黑色素瘤、结直抗体（1D4B）（BD Biosciences 公司，美国）；佛波脂醇
肠癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多种实体肿瘤，和离子霉素刺激剂（eBioscience 公司，美国），DMEM
［2］
有着密切的关系。miR⁃16/miR⁃15a可以直接靶向细胞培养基（Gibco 公司，美国）；胰酶细胞消化液、
多种致癌基因，也可以靶向抑制生长因子的分泌，红细胞裂解液（上海碧云天）；胎牛血清（Biological
从而发挥抗肿瘤活性［3-4］。 Industries公司，以色列）；DNase Ⅰ（上海生工）；Dis⁃
NKG2D 是表达于自然杀伤（natural killer，NK） paseⅡ（Roche Applied Science 公司，美国）；胶原酶
和CD8 T细胞的重要活化性受体之一。NKG2D转 Ⅳ（Sigma公司，美国）。
［5］
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录后水平可受miRNA调控，如miR⁃182可与NKG2D 1.2 方法
［6］
的 3′⁃非翻译区（3′⁃UTR）结合下调 NKG2D 表达。 1.2.1 观察 miR⁃16/15a 小鼠对结肠癌移植瘤的敏
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通过生物信息学分析，我们在小鼠 NKG2D 基因 3′⁃ 感性
UTR 区发现了 miR⁃16 结合的互补基因区（图 1），然收集对数期小鼠结肠癌MC⁃38细胞按2×10 个/只
6
而 miR⁃16 是否通过调节 NK 细胞 NKG2D 的表达进皮下注射miR⁃16/15a 小鼠（KO）和同型对照C578L/
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而参与肿瘤的调控，目前尚不清楚。 6 小鼠（WT）。每天观察移植瘤生长情况和小鼠状
态，体外测量移植瘤长、宽、高并计算体积。第21天
miR⁃16：AAAAGC*GGUUAUAAAUGC*ACGAC*GA⁃5′
时取出移植瘤和小鼠脾脏，进行下一步分析。
NKG2D 3′⁃UTR：UCCACGUUUCAUAUUUAAAAUUCAAACUCC⁃3′
1.2.2 RT⁃PCR法检测小鼠NK细胞miR⁃16的表达
图1 miR⁃16与NKG2D 3′⁃UTR的互补序列分离 C57BL/6 小鼠脾脏并制备淋巴单细胞悬
Figure 1 Complementary sequence of miR⁃16 and NKG2D 液，通过BD流式细胞仪分选NK1.1 NKG2D 细胞和
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3′⁃UTR
NK1.1 NKG2D 细胞，用 TRIzol 分别提取各组细胞
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本研究观察了 MC38 结肠癌移植瘤在 8 周龄总 RNA，分光光度计测量其纯度及浓度，并取1 μg，
miR⁃16/15a 小鼠体内的生长情况，以及生理及荷瘤采用Mir⁃X miRNA First⁃Strand Synthesis Kit逆转录
TM
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状态下 NKG2D NK 细胞和 NKG2D NK 细胞内 miR⁃ 成 cDNA，逆转录条件为 37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。
16表达的变化。同时利用miR⁃16/15a 小鼠研究生然后，以 cDNA 为模板，进行荧光定量 PCR，反应条
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理及荷瘤后NK细胞的活性变化，为深入了解miR⁃16 件为 95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 个循环。荧
调节NK细胞生物学活性提供重要实验依据。光定量 PCR 采用 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒，
TM
设计上游引物 miRNA⁃16⁃1 序列为 5′⁃TAGCAG⁃
1 材料和方法
CACGTAAATATTGGCG⁃3′，下游引物为试剂盒的
1.1 材料通用引物。以 snRNA 中的 U6 作为内参基因，其上
1.1.1 实验动物及细胞系下游通用 PCR 引物均由试剂盒提供。结果采用相
miR⁃16/15a 小鼠为本实验室自美国Jackson实对定量方法对目的基因的表达量进行分析，实验
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验室引进，并于扬州大学比较医学中心繁殖，重复 3 次。
C57BL/6 小鼠购自扬州大学比较医学中心，所有使 1.2.3 流式细胞术检测 miR⁃16/15a 小鼠 NK 细胞
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用实验动物均为 8 周龄。饲养环境为：温度 20~ 的表型和功能
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25 ℃，湿度50%左右，正常昼夜更替，12 h 光照/12 h 分离 8 周龄的 miR⁃16/15a 小鼠和同型对照小
无光照交替进行的方式模拟，自由饮水进食。所有鼠的脾脏并制备淋巴单细胞悬液，通过流式细胞术
动物实验严格按照动物实验规范执行。饲养小鼠分别检测CD3 NK1.1 和 CD3 NK1.1 NKG2D 细胞频
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结肠癌细胞系 MC38 细胞株和小鼠淋巴瘤细胞率。用流式细胞术进行胞内染色时，用细胞刺激
（YAC⁃1细胞）由本实验室常规保存。剂体外培养淋巴细胞 4 h 后，Brefeldin A 阻断转运
1.1.2 主要试剂和释放，标记 NK1.1 和 IFN⁃γ抗体，检测 NK 细胞分
TM
RNA 逆转录试剂盒 Mir⁃X miRNA First⁃Strand 泌的 IFN⁃γ。另外，用脾脏单细胞悬液按 3∶1、1∶1、
TM
Synthesis Kit、DNA 合成酶 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 1∶3 的效⁃靶比例，分别与小鼠淋巴瘤细胞（YAC⁃1
（TaKaRa公司，日本）；APC⁃NK1.1抗体（PK136）、PE⁃ 细胞）共孵育后，以 CD107a 标记法检测 NK 细胞的
NKG2D抗体（6d5）、FITC⁃CD3抗体（17A2）、PE⁃IFN⁃ 脱颗粒活性。

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