Page 23 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 23
第41卷第7期 朱浩然，张 鑫，祁俊侠，等. 利用双引导RNA的CRISPR/Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠［J］.
2021年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：949-955 ·953 ·
组同源序列形成非特异结合，可能最终导致Cas9错 性，选取经 PCR 鉴定获得的野生型和基因敲除纯合
误切割 ［12-13，15］ 。因此我们通过在线软件 Off⁃Spotter 小鼠，用 RT⁃PCR 和 Western blot 检测其 mRNA 和蛋
进行脱靶位点预测，分别选取 2 个脱靶概率最大的 白水平的表达情况。提取野生型和敲除小鼠不同
位点进行后续检测（表3）。随后我们针对筛选后的 组织（嗅球、下丘脑、海马、丘脑、中脑、小脑、脑桥、
脱靶预测位点设计引物以进行测序分析，结果显示 胰腺、肾、睾丸、肌肉、棕色脂肪和白色脂肪等）的总
所有预测位点测序结果正确（图 4），未发生脱靶效 RNA，在敲除位点两侧设计引物（表 1），通过 RT⁃
应造成的基因突变。 PCR 鉴定不同组织中的基因表达情况。Nudt3基因
2.5 Nudt3基因敲除小鼠的NUDT3表达水平检测 敲除小鼠各组织的mRNA RT⁃PCR 产物电泳条带显
为了进一步确认 Nudt3 基因敲除小鼠的可靠 示，Nudt3 基因敲除小鼠电泳条带与野生型电泳条
A B
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 WT Water
Nudt3 +/+
1 000
750
672
500
Nudt3 +/-
279
250
Nudt3 -/-
A：基因鉴定电泳图。M：Marker；5、6、8：纯合子（Nudt3 ）；1、3、4、7：杂合子（Nudt3 ）；2：野生型（Nudt3 ）；WT：野生型对照；Water：空白对
+/-
-/-
+/+
照；B：基因鉴定测序图（红色箭头为突变起始位点）。
图3 部分F2代小鼠基因鉴定结果
Figure 3 The genotyping results of F2⁃generation mice
表3 小鼠基因组脱靶预测位点序列
Table 3 The predicted off⁃target site DNA sequences in mice
gRNA名称 预测位点名称 位置 预测脱靶位点序列（5′→3′）
gRNA⁃1 gRNA⁃1⁃A Chr1：+ TTAGCAGCCATCTTGACCGA
gRNA⁃1⁃B Chr10：- GTACCACCCAGCCAGACCGA
gRNA⁃2 gRNA⁃2⁃A Chr18：+ CTGCTGAGTAACATTGCGGA
gRNA⁃2⁃B Chr11：+ ATTTTCAGTTAATTTGCGGA
gRNA⁃1⁃A gRNA⁃1⁃B
gRNA⁃2⁃A gRNA⁃2⁃B
图4 脱靶预测位点测序结果
Figure 4 The sequencing results of the predicted off⁃target sites
