Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第7期
·954 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年7月

带相比缺失 100 bp 左右，测序比对后发现 Nudt3 果与RT⁃PCR的结果一致，验证了Nudt3基因的敲除
基因敲除小鼠 mRNA RT⁃PCR 产物比野生型缺失 效果，证明Nudt3基因全身敲除小鼠模型构建成功。
112 bp，表明 Nudt3 基因在多个组织敲除成功（图
3 讨 论
5A）。
提取野生型和敲除小鼠不同组织（下丘脑、大 本研究对Nudt3基因在小鼠脑组织和外周代谢
脑皮层、肝脏和心脏）的蛋白后，通过Western blot鉴 器官的表达进行了检测，结果显示该基因在机体各
定不同组织中的表达情况。结果显示，基因敲除小 组织中广泛表达，提示 Nudt3 基因可能在多个组织
鼠的多个组织中无NUDT3蛋白表达（图5B）。该结 中发挥作用。中枢神经系统中的下丘脑是调控全

A B
嗅球 下丘脑 海马 丘脑 中脑 小脑 脑桥 下丘脑
bp M WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO
300 NUDT3 19 kDa
250
Nudt3 200
150
GAPDH 36 kDa
嗅球 下丘脑 海马 丘脑 中脑 小脑 脑桥 大脑皮层
bp M WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO
300
Actb 250 NUDT3 19 kDa
200
150
GAPDH 36 kDa
胰腺 肾 睾丸 肌肉 棕色脂肪 棕色脂肪 肝脏
bp M WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO
WT KO
300
Nudt3 250 NUDT3 19 kDa
200
150
GAPDH 36 kDa
胰腺 肾 睾丸 肌肉 棕色脂肪 棕色脂肪
心脏
bp M WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO WT KO
WT KO
300
Actb 250 NUDT3 19 kDa
200
150
GAPDH 36 kDa
A：小鼠Nudt3 mRNA RT⁃PCR产物凝胶电泳检测结果；B：小鼠NUDT3蛋白水平检测；M：Marker；WT：Nudt3 小鼠；KO：Nudt3 小鼠。
-/-
+/+
图5 小鼠Nudt3 mRNA和NUDT3蛋白表达水平
Figure 5 The expression of Nudt3 mRNA and NUDT3 in mice
身能量代谢的总中枢，因此是本研究重点关注的对 对较小 ［11］ ，已经成为了最常用的基因编辑技术，目
象。相对于其他脑组织，Nudt3 基因的表达在下丘 前已被广泛应用于构建基因编辑小鼠模型 ［16-19］ 。本
脑中的表达并不是最高。但是在高脂饮食诱导下， 研究利用 CRISPR/Cas9 技术设计原理，在 Nudt3 基
Nudt3基因的表达显著下降，提示Nudt3基因在下丘 因的第2个外显子区域设计了2对gRNA，该设计有
脑中可能发挥着重要作用。此外，我们在肾脏、肝 利于增加基因的编辑效率。 通过向小鼠受精卵中
脏和脂肪组中，均发现 Nudt3 基因在高脂肪诱导下 显微注射Cas9蛋白和gRNA，并进行胚胎移植后，我
有显著的表达差异，提示其可能在能量代谢中发挥 们获得了多个新生小鼠。基因测序结果显示靶位
重要作用，值得进一步研究。因此，构建Nudt3基因 点有多个缺失或者插入等基因编辑现象。该结果
敲除小鼠具有重要的学术研究价值。 是典型的基因编辑后多种基因型细胞嵌合的现
CRISPR/Cas9 技术是目前发展迅速，并广泛应 象。由于基因编辑发生在胚胎发育的早期，生殖细
用的基因编辑技术 ［10］ 。相对于锌指核酸酶（zinc⁃ 胞有类似的嵌合现象，通过进一步育种可以获得单
finger nucleases，ZFN）和转录激活因子样效应物核 一基因型的基因编辑动物。后续的检测证实了这
酸 酶（transcription activator ⁃ like effector nucleases， 一 点 ，本 研 究 获 得 了 单 个 基 因 编 辑 型 的 小 鼠 。
TALEN），CRISPR/Cas9技术设计简单且脱靶效应相 CRISPR/Cas9技术存在的一个问题是脱靶效应导致