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第41卷第7期 刘 爽，陈 曦，周国平. 转录因子E2F4对哮喘相关基因Six1的转录调控［J］.
2021年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：943-948 ·945 ·

重复分析，并使用2 -ΔΔCt 方法评估相对表达水平。具 定，结果提示此片段核苷酸序列与人Six1基因启动
体引物列于表1。 子区序列一致，说明人Six1基因启动子区已经成功
插入pGL3⁃basic载体中。如图1所示，与pGL3⁃basic
表1 小干扰序列和qRT⁃PCR引物
Table 1 Sequences of siRNAs and qRT⁃PCR primers 组相比，转染pSix1⁃451片段质粒的HEK⁃293和BE⁃
名称 序列（5′→3′） AS⁃2B 细胞相对荧光素酶活性明显增加，差异有统
计学意义（P < 0.001）。结果表明，人 Six1 启动子荧
siE2F4 正义链：GCGGCGGAUUUACGACAUUTT
反义链：AAUGUCGUAAAUCCGCCGCTT 光素酶报告重组质粒转染至 HEK⁃293 和 BEAS⁃2B
siNC 正义链：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 细胞后具有启动子活性。
反义链：ACGUGACACGUUCGGAGAATT 2.2 人Six1启动子区转录因子结合位点预测
E2F4 上游引物：CGGGGTACCGCAATGCCGAGACTGACAAG
根据上述人 pSix1⁃451 片段质粒的荧光素酶活
下游引物：CCGCTCGAGTTCATCCCCAAATGGTCTAAG
性检测结果分析，提示-351~+100 nt 区域内可能存
Six1 上游引物：AAGGAGAAGTCGAGGGGTGT
在明显影响人 Six1 启动子活性的转录因子结合位
下游引物：TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT
点，应用JASPAR对该区域进行分析，获得可能的转
β⁃actin 上游引物：AAAGACCTGTACGCCAACAC
录因子结合位点。如图 2 所示，预测结果提示该序
下游引物：GTCATACTCCTGCTTGCTGAT
列范围内可能存在E2F4等转录因子结合位点。
1.2.6 蛋白免疫印迹实验 2.3 转录因子E2F4对Six1启动子水平的调控
使用试剂盒从细胞系中提取总蛋白，然后加入 为了确定E2F4能否直接调节人Six1的转录，我
5×上样缓冲液并100 ℃煮沸10 min。配制10% SDS⁃ 们在 HEK⁃293 和 BEAS⁃2B 细胞中分别敲低和过表
PAG凝胶，80 V预电泳后100 V恒压分离蛋白，分离 达转录因子E2F4。如图3所示，与siNC处理的对照
蛋白后恒流 250 mA，120 min 转至 PVDF 膜，室温下
120 HEK⁃293
5%脱脂奶粉溶液封闭 2 h 后 4 ℃孵育一抗过夜，使 ***
BEAS⁃2B
用 TBST 洗膜后室温孵育二抗 1 h，再次洗膜后加曝 80 ***
光液曝光显影。使用 GAPDH 作为内参，实验独立
重复3次。 相对荧光素酶活性 40 2
1.3 统计学方法
采用GraphPad Prism 7及SPSS 22.0软件对数据 1
进行统计分析。实验结果以均数±标准差（x ± s）表 0
pGL3⁃Basic pSix1⁃451
示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计
与pGL3⁃Basic相比， P < 0.001（n=3）。
***
学意义。
图1 荧光素酶报告基因分析HEK⁃293和BEAS⁃2B细胞中
2 结 果 人Six1启动子活性
Figure 1 Human Six1 promoter activity in HEK⁃293 and
2.1 人Six1启动子活性检测 BEAS ⁃ 2B cells analyzed by luciferase reporter
将合成的 pSix1⁃451 片段质粒进行核酸序列测 system

TTGTGCGGAGTTGTGCGCGACTCCCCTTAGGTGATACTGGCGACGGGTCCCGCGTTGCAGGGTCCTG
En1
ACGCGCTCACCCACTCCCTACCTCCCCACACCTCCGCAGCGCAGCTCCCTCAGACCCCAACTGGCTT

CCCACCTTTCCTCTTCCTTCTCCTCCCACCACTCCCTACCCGCGCAGCCCCGGCAACACCCCCAACCCC
FIGLA E2F3
CAGCTCCGCAGCCTCGCCCTCCCCGCTCTGGGCGGTGCGGCCTCTCTGCCCAGCCGGGCGGCGCGC

TGGCTGGCCAGCCCCGGATAGGCGCCGCCGGCAGCCAATCAGCGTGCCGGGGACGCTGCGCGCTTTA
AGGCCGCTGCGGGGAGAACAGAAACCAAGTTCCCCGGCAACTAGCAGCATCCACCGGGCGGGAGGTC
HINFP ETS1 E2F1 E2F4
GGAGGCAGCAAGGCCTTAAAGGCTACTGAGTGCGCCGGCCGTTCCGTG
GATA3 ETS1
图2 运用JASPAR网站预测转录因子结合位点
Figure 2 Predication of binding sites of transcriptional factors by JASPAR