Page 78 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第8期
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              国），终浓度为 5 μmol/L 的 ADP（Chronolog 公司，美             组结果，将氯吡格雷低反应组和对照组患者的总
              国），氢氧化钠、盐酸、冰醋酸（上海凌峰化学试剂有                          RNA 分别混为 2 个 RNA 池。分别从 2 组 RNA 池中
              限公司），乙二胺四乙酸、琼脂糖、MOPS、PBS 粉剂                       取RNA样本1.5 μg，按照相应配比加入10×MOPS、甲
             （合肥Biosharp公司），枸橼酸钠（西陇化工股份有限                       醛、甲酰胺并混匀，用1%琼脂糖凝胶进行变性电泳。
              公司），无水乙醇、甲醛（上海国药集团化学试剂有                           1.2.3 测序文库的构建及测序
              限公司），DEPC 水（Invitrogen 公司，美国），甲酰胺                      每例样本取 1.5 μg 总 RNA 行 15%尿素聚丙烯
             （上海麦克林生化科技有限公司），5 mL枸橼酸钠1∶                         酰胺凝胶电泳，电泳后对18~32 nt片段进行切割、洗
              9 抗凝的采血管（BD 公司，美国），CD45 抗体、LD 磁                   脱、纯化回收。采用 Small RNA Sample Prep Kit（Il⁃
              珠分选柱（Miltenyi Biotec 公司，德国），0.22 μm无菌             lumina，美国）构建小RNA文库。纯化后的小RNA序
              滤器（Merck Millipore公司，德国）。                         列采用T4 RNA连接酶将接头引物分别连接至2个文

              1.2  方法                                           库的序列 5′端和 3′端，逆转录合成 cDNA 第一链，
              1.2.1 血小板聚集率测定                                    PCR建立小RNA文库。利用Illumina HiSeq 2500测
                  在患者服用氯吡格雷后2.5 h，用含3.2%枸橼酸                     序平台对该文库进行高通量测序。

              钠抗凝管采集肘静脉血样8 mL，并于标本采集后2 h                        1.2.4 小RNA数据处理和信息分析
              内完成 LTA 法血小板聚集功能检测，具体方法如                               测序所得长度为51 nt 的小RNA 序列通过去接
              下：在常温下将采集的血标本以200 g离心8 min，用                      头、去除低质量和污染序列，最终获得18~32 nt的高
              移液枪缓慢抽取离心后血标本的上清液以获取富                             质量小 RNA 序列。统计小 RNA 的种类、数量及长
              血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）；用全自动血             度分布，初步判断小RNA质量。采用mirdeep2软件
              液分析仪检测PRP中的血小板计数；将吸取PRP后                          将所得小RNA序列与参考基因组进行比对分析，再
              剩余的血样常温下以2 460 g离心10 min，用移液枪                     将匹配序列分别与 GenBank 和 Rfam 10.0 数据库进
              缓慢抽取血标本的上清液以获取贫血小板血浆                              行对比，筛选出 miRNA 序列并分类注释，分析其表
             （platelet poor plasma，PPP）；用 PPP 作为稀释液将            达情况。
              PRP中的血小板浓度稀释至 250×10 /L（如PRP中的                    1.2.5 miRNA差异表达分析
                                              9
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              血小板浓度在250×10 /L以下，则无需稀释）；向PRP                          将样本中的 miRNA 表达量标准化为 TPM（tags
              中加入2.5 μL终浓度为5 μmol/L的ADP，测定8 min                 per million），应用 EdgeR 软件对 2 对样本已知 miR⁃
              最大血小板聚集率。                                         NA表达差异分析统计。将“差异倍数”绝对值≥2且
                  参照CREST研究，将ADP诱导的血小板聚集率                       P < 0.05的miRNA定义为差异表达的miRNA。差异
             （platelet aggregation induced by adenosine diphos⁃  倍数=Log2 （氯吡格雷低反应组 miRNA 标准化的表
              phate，PLADP ）大于上四分位数定义为氯吡格雷低反                     达量/对照组miRNA标准化的表达量）。
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              应性 ，小于下四分位数者设为对照组。                                1.3  统计学方法
              1.2.2 血小板纯化与RNA提取及变性电泳                                 计量资料经正态检验符合正态分布者采用均
                  在患者进行冠状动脉造影时，经鞘管采集15 mL                       数±标准差（x ± s）表示，两组计量资料的比较采用独
              动脉血于枸橼酸钠抗凝管，以 200 g 离心 10 min，移                   立样本的 t 检验；不符合正态性分布者用中位数与
              取上层 PRP，用免疫磁珠法分选白细胞与血小板比                          四分位数［M（P25，P75 ）］表示，组间比较采用非参数
              例低于 1∶5 000 000 的纯化血小板（具体操作参考                     检验中的秩和检验；计数资料以百分率表示，计数
              CD45 MicroBeads LD 磁珠分选柱的说明书）。用                   资料比较采用χ 检验或 Fisher’s 精确检验。所有数
                                                                              2
              TRIzol 裂解上述纯化血小板，再用 mirVana             TM  miR⁃  据采用 SPSS 20.0 统计学处理，P < 0.05 为差异有统
              NA Isolation Kit 提取裂解后血小板中的总 RNA（具                计学意义。
                                         TM
              体操作参考 TRIzol 及 mirVana miRNA Isolation Kit
                                                                2  结 果
              说明书），最终将每份样本的总 RNA 溶解于 20 μL
              无 RNase 的的 DEPC 水中置-80 ℃冰箱储存。通过                   2.1  临床基线资料及患者分组
              Nanodrop 分光光度计检测每个样本总 RNA 的浓度                          根据入选患者的 PLADP 结果计算出四分位数
              及 260 nm/280 nm 的吸光度（OD）比值，确认每个总                  P25=19.5%，P75=48.5%。选取PLADP＞48.5%的氯吡格
              RNA 样本的 OD 比值均在 1.8~2.0 之间。按上述分                   雷低反应性患者19例为低反应组，为了更明显地筛
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