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第41卷第9期      林少清，舒     磊，杜兴冉，等. 铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1抑制肺巨噬细胞吞噬功能的初步研究［J］.
                  2021年9月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1304-1309                      ·1305 ·


                                              ［3］
                染成为备受关注的公共卫生问题 。当 PA 及其分                          异 引 物 ，上 游 引 物 ：5′ ⁃ ATGAGTGTCCGCTTTC⁃
                泌的毒性分子作用于机体时，主要由巨噬细胞、中                            GCCCCCTGGAT⁃3′；下游引物：5′⁃TCAGCGAATTC⁃
                性粒细胞及 NK 细胞等固有免疫细胞进行防御，研                          CACCGTCGC⁃3′，引物及反应模板均由南京金斯瑞公
                究表明，巨噬细胞在抵抗 PA 肺部感染过程中具有                          司设计并合成。PCR 反应条件：95 ℃预变性 2 min；
                        ［4］
                重要作用 。                                            95 ℃变性 1 min、60 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 1 min，进
                    吞噬是巨噬细胞清除细菌的首要环节，肺泡巨                          行30个循环；最后在72 ℃延伸10 min。扩增的PCR
                噬细胞吞噬受阻是下呼吸道感染加重的重要原因                             产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察条
                之一  ［5-6］ 。PA 可通过鞭毛、分泌蛋白及其群体感应                    带。试剂盒纯化扩增产物，NdeⅠ与 HindⅢ双酶切
                系统（quorum sensing，QS）等多种方式影响巨噬细                   纯化的 PCR 产物，并插入 pMD19⁃T 质粒，16 ℃过
                胞的吞噬功能，从而在较大程度上影响感染的进                             夜。用氯化钙法将 pMD19⁃T⁃pec1 质粒转化大肠杆
                程 ［7-9］ 。研究发现，PA的重要毒性因子绿脓菌素在体                     菌DH5a感受态细胞，在含有IPTG和X⁃gal的抗氨苄
                内外均能抑制巨噬细胞对机体凋亡细胞的吞噬 ；                            青霉素 LB 平板上 37 ℃孵育过夜，挑选阳性菌落进
                                                           ［8］
                Zhang 等 ［10］ 研究表明，敲除PA的毒性因子调节蛋白                   行酶切鉴定。将酶切正确的重组质粒 pMD19⁃T⁃
                AnvM后，则能促进小鼠肺泡巨噬细胞MH⁃S对PA的                        pec1 经 NdeⅠ和 HindⅢ酶切后，插入至表达载体
                吞噬效应；与上述不同的是，有学者研究发现，PA 群                         pET⁃30a（+），转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，在
                体感性系统的rhlI表达则有利于巨噬细胞对PA的吞                         含抗氨苄青霉素 LB 平板上 37 ℃孵育过夜，选择阳
                 ［11］
                噬 。这些结果表明，PA的结构物或分泌物可以不                           性克隆进行测序和酶切鉴定。
                同方式影响巨噬细胞的吞噬功能。因此，研究PA对                           1.2.2 重组蛋白Pec1的诱导表达和纯化
                肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响对探究PA感染机制有                               将携带 pET⁃30a⁃pec1 重组表达载体的单克隆
                重要意义。                                             E.coli BL21（DE3）接种于含卡那霉素（100 μg/mL）的
                    我们前期在对 PA 部分分泌蛋白的抗原性筛选                        LB 培养基中，37 ℃ 200 r/min 培养过夜。再转接至
                时发现，Pec1 有一定的抗原性。Pec1 是 PA 感染状                    含卡那霉素（100 μg/mL）的 TB 培养基中，37 ℃培养
                态下分泌的一种蛋白，由275个氨基酸构成，并且研                          4 h，再加入 IPTG，15 ℃下诱导 16 h。收集细胞，裂
                究发现，Pec1 是一种潜在的毒性因子              ［12］ ，但其在 PA     解细胞后的上清过镍亲和层析柱，经洗脱液洗脱
                致病过程中的具体功能及作用机制尚未见报道。                             后，收集纯化洗脱液。SDS⁃PAGE 电泳分析条带，
                为此，本研究拟观察重组PA分泌蛋白Pec1对MH⁃S                        BSA测定蛋白浓度，经0.22 μm滤膜过滤后，将蛋白
                细胞吞噬功能的影响。                                        分装冻存于-80 ℃。
                                                                  1.2.3 CCK⁃8法检测细胞增殖水平
                1  材料和方法
                                                                      将MH⁃S细胞以1×10 个/孔接种于96孔板中，培养
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                1.1  材料                                           过夜后，分别加入浓度为0、10、20、40、80、160 μg/mL
                    PA野生株（PAO1）为南京医科大学第二附属医                       的重组蛋白 Pec1 进行刺激，每个浓度设 5 个平行复
                院实验中心保存菌；大肠埃希菌（E.coli）DH5α、大肠                     孔。培养箱内分别孵育 24、48、72 h 后，每孔加入
                埃希菌感受态细胞 E.coli BL21（DE3）、pMD19⁃T 以               CCK⁃8 试剂 10 μL，继续孵育 1.5 h，使用酶标仪在
                及pET⁃30a（+）（Novagen公司，美国）；小鼠肺泡巨噬                  450 nm波长读取吸光度值。
                细胞株 MH⁃S 细胞（上海中乔新舟公司）；DNA 连接                      1.2.4 吞噬中性红实验

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                酶、DNA 聚合酶和限制性内切酶 NdeⅠ与 HindⅢ                          于 12 孔板中接种 MH⁃S 巨噬细胞 2×10 个/孔，
               （Invitrogen 公司，美国）；PCR 扩增试剂盒、PCR 产物                培养过夜后，分别加入浓度为 0、40、80、120 μg/mL
                纯化试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒                          的重组蛋白 Pec1 刺激 24 h。PBS 洗涤 3 遍后，加入
                及镍柱（南京金斯瑞公司）；CCK⁃8 细胞增殖检测试                        0.01%中性红溶液200 μL/孔，吞噬30 min后，用PBS
                剂盒、中性红染液、吖啶橙AO染色试剂盒以及碘化                           洗 3 遍，加入裂解液作用 30 min，使用 Bio⁃Rad 酶标
                丙啶PI染色试剂盒（南京凯基生物公司）。                              仪于562 nm波长处读取吸光度值。吞噬指数=各浓

                1.2  方法                                           度实验孔吸光度值/对照孔吸光度值。
                1.2.1 引物的合成和重组质粒的构建                               1.2.5 荧光显微镜观察吞入胞内的灭活PAO1
                    根据 NCBI 的 PAO1 菌株信息设计 Pec1 序列特                    以 2×10 个/孔接种 MH⁃S 细胞于 12 孔板，培养
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