Page 41 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第9期 林少清，舒 磊，杜兴冉，等. 铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1抑制肺巨噬细胞吞噬功能的初步研究［J］.
2021年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1304-1309 ·1307 ·

M 1 2 3 4 氧化氢酶、抗菌肽等杀伤病原微生 ［13］ ，此外，中性粒
细胞还可通过胞外陷阱杀伤病原体 ［14］ 。Thanabalas⁃
uriar 等 ［15］ 在体内实验研究发现，敲除 PA 分泌的胞
120 kDa
外多糖psl（ΔpslA）能促进中性粒细胞对敲除株的识
80 kDa
60 kDa 别与吞噬，且体外实验也能证实这种现象，表明 psl
有助于 PA 逃避中性粒细胞识别，机制可能与其抑
40 kDa
30 kDa 30.5 kDa 制补体在 PA 表面激活与沉积有关；另有学者研究
发现，被巨噬细胞吞入的 PA 能依赖于铜绿假单胞
20 kDa
菌Ⅲ型分泌系统（T3SS）分泌的ExoS促进PA从巨噬
10 kDa
细胞囊泡中逃脱，从而利于PA的免疫逃逸 ［16］ ；Yu等
M：蛋白marker；1：BSA（1 μg）；2：BSA（2 μg）；3：未诱导的 pET⁃ ［17］ 研究表明，T3SS 的蛋白 PcrV，可促进巨噬细胞株
30a⁃pec1菌体裂解液上清；4：经IPTG在15 ℃下诱导16 h的pET⁃30a⁃
RAW264.7 对 PA 的吞噬，同时，可促进小鼠骨髓来
pec1菌体裂解液上清，箭头指示重组蛋白Pec1条带。
图2 重组蛋白Pec1的SDS⁃PAGE分析 源巨噬细胞（bone marrow⁃derived macrophage，BM⁃
Figure 2 SDS⁃PAGE analysis of the recombinant protein DM）向促炎型M1型分化，增加iNOS、ROS、TNF⁃α等
Pec1 细胞因子的分泌，从而有利于巨噬细胞对 PA 生物
膜的清除。由此可见，PA可以分泌多种不同毒性因
2.5
24 h 子，而不同毒力因子对宿主免疫细胞的免疫效应影
48 h
2.0 ** *** ** 响不同，本研究主要探讨了 PA 分泌蛋白 Pec1 对巨
72 h
nm ） 1.5 *** *** *** 噬细胞吞噬功能的影响。
* ***
***
（ 450 *** ** *** *** *** 本研究成功构建了 PA 重组蛋白 Pec1，以不同
D 1.0
浓度的 Pec1 蛋白刺激 MH⁃S 细胞 24、48、72 h 后发
0.5 *** *** ***
现，Pec1 浓度越高，MH⁃S 细胞的增殖能力越弱，其
0.0 中，以 120 μg/mL 作用 72 h 的抑制作用最强。同时
0 10 20 40 80 120 160
Pec1浓度（μg/mL） 观察发现，Pec1 浓度越高，巨噬细胞对中性红和 PA
在相同时间及培养条件下，与对照组相比，P < 0.05，P < 0.01，
**
*
的吞噬能力越低。这些结果表明，PA 蛋白 Pec1 能
P < 0.001（n=3）。
***
图3 Pec1对MH⁃S细胞增殖的影响 对MH⁃S细胞的吞噬作用产生抑制效应。
Figure 3 Effect of the recombinant protein Pec1 on MH⁃S 近年来，有不少学者将吞噬与自噬相联系，自噬
cell proliferation 可通过异体自噬和LC3相关吞噬作用（LC3⁃associat⁃
ed phagocytosis，LAP）参与病原微生物的清除 ［18- 19］ 。
1.5 ** Pehote等 ［20］ 发现，RAW264.7小鼠巨噬细胞经香烟烟
** 雾暴露处理后，敲除调控自噬溶酶体基因表达的转
*
录因子 EB（transcription factor EB，TFEB）的处理组，
吞噬指数 1.0 与对照组相比，巨噬细胞对PA吞噬减少，同时也抑
制了其对PA的清除。研究发现，酪氨酸蛋白Lyn是
0.5
联系吞噬与自噬的关键分子。PA 感染MH⁃S 后，经
TLR4/TLR2 识别入胞，一方面，通过磷酸化 Lyn，将
0.0 包裹 PA 的吞噬体经 Rab 家族蛋白（如 Rab5、Rab7）
0 40 80 120
Pec1浓度（μg/mL） 运输至溶酶体；另一方面，磷酸化的Lyn启动异体自
两组比较，P < 0.01，P < 0.001（n=3）。 噬，形成包裹PA的自噬体运至溶酶体，最终包裹PA
**
*
图4 Pec1对MH⁃S细胞吞噬中性红的影响 的双层膜囊泡与溶酶体融合并在其内降解 ［21］ 。而
Figure 4 Effect of the recombinant protein Pec1 on phago⁃ Wu 等 ［22］ 发现，β⁃防御素 2 和β⁃防御素3通过下调早
cytosis of neutral red by MH⁃S cells
期生长反应基因⁃1（the early growth response gene⁃1，
作用的主要固有免疫细胞，当入侵的病原体被吞入 Egr⁃1）和原癌基因 c⁃FOS 抑制巨噬细胞自噬，促进
细胞内，细胞通过释放胞内活性分子（活性氧）、过 巨噬细胞对酵母多糖的吞噬作用，促进PA 的清除。