Page 45 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 45

第41卷第9期             李   昊，张林凯，张 晶. 凋亡抑制蛋白c⁃FLIP（L）调控肺纤维化过程的机制［J］.
                  2021年9月                  南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1310-1314，1341                   ·1311 ·


                TGF⁃β）］和白细胞介素（interleukin，IL）等参与肺组                GUCUGUUCAAGGAGCATT⁃3′）（上海吉玛制药技术
                织重构，导致肺纤维化的发生。                                    有限公司）。
                    TGF⁃β被认为是肺纤维化进程中最重要的细胞                        1.2  方法
                因子，作为关键性的致纤维化因子参与肺纤维化的                            1.2.1 BLM诱导小鼠肺纤维化模型的建立及鉴定
                损伤和修复过程，并且它能诱导肺泡上皮细胞向间                                C57BL/6小鼠采用随机法分为对照组、BLM组，
                质细胞转化。研究发现，上皮⁃间质转化（epithelial⁃                    每组 6 只。各组小鼠腹腔注射 50 μL 的 3%戊巴比
                mesenchymal transition，EMT）是肺纤维化发病机制              妥钠进行麻醉，仰卧固定在实验台上，将颈部皮肤
                中的一个关键步骤，肺上皮细胞发生EMT转化为成                           钝性分离暴露出气管。注射针头沿气管轻轻注入
                                                   ［3］
                纤维样细胞是导致肺纤维化的重要原因 。文献报                            0.1 mL BLM（2.5 mg/kg），对照组注入等量生理盐水，
                道在 IPF 患者的肺组织中检测到 c⁃FLIP（L）蛋白的                    注射完成后采用医用缝合线进行气管及周围皮肤
                异常表达    ［4-5］ 。c⁃FLIP（L）具有 caspase⁃8 类似结构，        的缝合。造模后 28 d 处死小鼠，取肺组织置于 4%
                由 DED 结构域和 caspase 样结构域组成，是一个无                    多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，按试剂盒说明进

                活性的蛋白酶样蛋白质。c⁃FLIP（L）作为 caspase⁃8                  行Masson染色及HE染色，显微镜观察肺组织结构。
                的抑制因子，能有效抑制死亡受体家族（death recep⁃                    1.2.2 免疫组化染色
                                       ［6］
                tor，DR）介导的细胞凋亡 。除了抗凋亡功能外，                             肺组织石蜡切片经 60 ℃烤片、常规脱蜡，抗原
                c⁃FLIP（L）还被报道参与了EMT介导的肿瘤细胞迁                       修复，3%H2O2室温孵育 15 min 等操作后进行封闭，
                移与转移，如在人非小细胞肺癌细胞中，TNF⁃α和                          3%山羊血清室温封闭30 min后，每张切片滴加适当
                TGF⁃β信号能够上调c⁃FLIP（L）表达，与细胞迁移密                     浓度的一抗溶液 50 μL，4 ℃过夜。次日，将切片
                      ［7］
                切相关 ，黑色素瘤 B16F10 细胞中 c⁃FLIP（L）高表                  PBST 漂洗 5 min×3 次，滴加 50 μL 聚合物增强剂（A
                                                           ［8］
                达促进 EMT 关键分子 Snail 表达，增强细胞运动 ，                    剂），室温30 min后PBST漂洗5 min×3次。然后，滴
                以及环状 RNAcircPVT1 调控 c⁃FLIP 表达，能增强                 加预备好的显色剂 DAB 工作液 50 μL 观察显色，用
                                         ［9］
                EMT诱导骨肉瘤的侵袭转移 。                                   流水冲洗终止显色。最后，切片进行分化、脱水、透
                    在肺纤维化过程中，c⁃FLIP（L）表达水平的变化                     明等一系列处理后，滴入中性树脂进行固定封片，
                影响了肺泡上皮细胞对凋亡的敏感性，那么它的表                            光学观察拍照。
                达是否还会影响肺上皮细胞发生EMT，成为肺纤维                           1.2.3 Western blot分析
                化发展的一个诱因呢？这是探究肺纤维化可能发病                                收集细胞样品收集细胞用预冷PBS 洗两次，加
                机制的新切入点，为靶向EMT的肺纤维化治疗提供                           入 RIPA 液（P0013，上海碧云天生物技术公司）裂解
                新的潜在靶点。本研究通过建立博来霉素（bleomy⁃                        细胞，冰上放置20 min 后12 000 r/min离心10 min，收
                cin，BLM）诱导的肺纤维化模型，探讨c⁃FLIP（L）表达                   集上清。蛋白质定量后加入上样缓冲液煮沸5 min。
                与EMT发生及肺纤维化的相关性。                                  取适量点样进行 10% SDS⁃PAGE 凝胶电泳及转
                                                                  膜。样品膜进行 5%脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h，包
                1  材料和方法
                                                                  被一抗溶液 4 ℃过夜。次日 PBST 洗膜 5 min×4 次，
                1.1  材料                                           包被二抗溶液室温 1 h，PBST 洗涤后滴加化学发光
                    C57BL/6 小鼠，8 周龄，雄性（体重 18~20 g），健              反应液，采用蛋白分析仪拍摄后进行结果分析。
                康 SPF级，购于南京大学模式动物研究所。人源肺                          1.2.4 Q⁃PCR分析
                癌上皮细胞株A549购自美国ATCC。FLIP⁃A549稳                         收取细胞，采用TRIzol法提取RNA，使用TaKaRa
                定表达细胞株为实验室保存。                                     逆转录试剂盒（北京宝日医生物技术公司）获得
                    戊巴比妥钠（上海生工公司），BLM（化药株氏会                       DNA。根据实验需要，取适量上述逆转录后的
                社，日本），Masson 染色试剂盒（福州迈新生物科技                       cDNA 配制 20 μL 体系，使用 Real⁃time PCR 仪进行

                有限公司）；FLIP 抗体（3210s，C Signaling Technolo⁃         PCR 扩增，采用 Quantitation⁃comparative CT（Livak）
                gy ）、Vimentin 抗体（BD 550513，BD Pharmingen ）        法即ΔΔCT法测定进行数据分析。所有 Q⁃PCR 引物
                                                           TM
                  TM
                和 E⁃Cadherin 抗体（#610181，BD Pharmingen ）（上         购于南京金斯瑞公司。E⁃cadherin引物：上游5′⁃TG⁃
                                                        TM
                海优宁维生物科技股份有限公司）；Smad⁃luc报告基                       CACCAACCCTCATGAGTG ⁃ 3′ 和 下 游 5′ ⁃ GTCAG⁃
                因（上海吉满生物科技公司）；FLIP siRNA（5′⁃GCA⁃                  TATCAGCCGCTTTCAG⁃3′；N⁃cadherin引物：上游5′⁃
   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50