Page 46 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第9期
               ·1312 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年9月


              GTCAGTATCAGCCGCTTTCAG ⁃ 3′ 和 下 游 5′ ⁃ ATT⁃                   对照组                   BLM组
              GATGCTGACGATCCCAATGCC⁃3′；Vimentin 引物：
              上游 5′⁃TCAAGTCCAGCTGCCACTGTGATCA⁃ 3′和
              下游 5′⁃TGCAGGCTCAGATTCAGGA⁃3′；GAPDH 引
                                                                  HE
              物：上游 5′⁃GAGCAGGTCTTGGTATTCACG⁃3′和下
              游5′⁃ CACCATCTTCCAGGAGCGAG⁃3′。
              1.2.5 Smad报告基因检测

                  A549 细胞接种于 24 孔板，次日转染质粒 DNA
             （含 Smad⁃luc 报告基因质粒和 pRL 质粒），24 h 后采
              用TGF⁃β1（10 ng/mL）处理12 h，吸弃培养液，PBS漂                  Masson
              洗1次，然后每孔加入50 μL passive lysis buffer 裂解
              20 min，细胞裂解液转入EP管4 ℃下12 000 r/min离
              心 10 min，取上清，采用双荧光素酶试剂盒（E1910，
              Promega 公司，美国），按说明书操作，上样测定荧光                          HE染色观察肺泡结构，Masson染色观察胶原表达及分布。
                                                                      图1 BLM构建肺纤维化模型的鉴定（×200）
              素酶的活性。
                                                                Figure 1  Identification of pulmonary fibrosis model con⁃
              1.3  统计学方法
                                                                         structed by BLM（×200）
                  采用 SPSS20.0 软件进行结果分析，数据用均
              数±标准差（x ± s）表示。多组间比较采用单因素方                        维化过程中EMT的发生。
              差分析，组间两两比较用SNK法，P＜0.05为差异有                        2.2  C⁃FLIP（L）高表达促进细胞EMT表型
              统计学意义。                                                 为了确定c⁃FLIP（L）表达参与肺上皮细胞EMT
                                                                的发生，在细胞水平上采用肺癌上皮细胞株A549为
              2  结 果
                                                                背景构建 c⁃FLIP⁃A549 稳定表达株，对其细胞形态
              2.1  c⁃FLIP（L）在肺纤维化中高表达与EMT相关                     学进行观察。与空载质粒构建的对照组相比，c⁃
                  采用BLM构建小鼠肺纤维化模型，造模28 d后                       FLIP⁃A549稳定株 #1和 #2细胞偏长梭形，细胞间黏
              处死小鼠，制备肺组织切片进行 HE 染色和 Masson                      附减少，显示出类 EMT 现象（图 3A），其 c⁃FLIP（L）
              染色（图 1）。HE 染色显示对照组肺泡结构呈现网                         表达水平升高（图 3B）。进一步对 EMT 标志分子
              孔状分布，而 BLM 组中肺泡结构遭到严重破坏，肺                         E⁃cadherin、N⁃cadherin、Vimentin 进行 qRT⁃PCR 检
              泡数量减少，形态不规则。Masson染色显示胶原沉                         测，结果显示 c⁃FLIP⁃A549 稳定株中 E⁃cadherin
              积，它是成纤维细胞增生的指标。对照组Masson染                         mRNA 表达下调而 N⁃cadherin mRNA 表达上调（P <
              色肺组织结构清晰，肺泡间隔未见增厚和纤维化表                            0.001，n=3），Vimentin mRNA 相应升高（P < 0.05，n=
              现，BLM 组肺组织中可见大量胶原沉积，肺纤维化                          3，图 3C）。这些标志物的变化说明 c⁃FLIP（L）高表
              严重，说明造模成功。                                        达能促进EMT发生。
                  E⁃Cadherin 是 EMT 的特异性上皮标志物，主要                 2.3 c⁃FLIP（L）调控TGF⁃β1诱导的EMT
              表达在肺泡上皮细胞表面。采用免疫组化染色来                                  采用 TGF⁃β1 诱导 A549 细胞 EMT 发生，检测
              验证c⁃FLIP（L）表达是否参与纤维化病程中EMT的                       c⁃FLIP（L）高表达对 TGF⁃β1 诱导 EMT 过程的影
              发生。免疫组化染色结果显示，E⁃Cadherin 在正常                      响。Smads 是细胞内重要的 TGF⁃β1 信号转导和调
              肺泡上皮细胞和柱状气管上皮细胞中大量表达，                             节分子，报告质粒 Smad⁃luc 的 luciferase 活性反映
              BLM 组纤维化的肺组织中 E⁃cadherin 表达下调，                    Smad 通路的激活状态。在 TGF⁃β1 刺激下，c⁃FLIP
              而 c⁃FLIP（L）染色结果与E⁃cadhesin变化相反，肺纤                 （L）过表达细胞表现出更强的 luciferase 活性（P <
              维化组织中 c⁃FLIP（L）表达升高，并且在其相应深                       0.05，n=3，图4），说明Smad通路的激活程度高，表明
              染位置上E⁃cadherin表现为低表达（图2A）。定量分                     c⁃FLIP表达能促进TGF⁃β1诱导的Smad信号通路的
              析显示，BLM组与对照组比较，E⁃cadherin下调以及                     激活。

              c⁃FLIP（L）上调，差异都有统计学意义（P < 0.01，n=                      为了进一步验证 c⁃FLIP（L）调控 EMT 发生，采
              3，图2B），这些关联提示c⁃FLIP（L）高表达参与肺纤                     用 c⁃FLIP siRNA 干扰片段敲减内源性 c⁃FLIP（L）的
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