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第41卷第9期 章海军，黄嘉琛，钱考亮，等. α7⁃nAChR通过抑制软骨细胞凋亡延缓小鼠膝骨关节炎关节软骨退变［J］.
                  2021年9月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1315-1321                      ·1317 ·


                射等体积的生理盐水。第28天小鼠处死后，取左后                           加破膜工作液覆盖组织。按片子数量和组织大小
                膝关节软骨组织标本进行实验。上述操作程序均                             取 TUNEL 试 剂 盒 内 适 量 试 剂 1（TdT）和 试 剂 2
                严格按照国际疼痛研究协会伦理委员会的规章、实                           （dUTP）按1∶9混合，覆盖组织。随后将切片平放于
                验室动物管理和使用指南（中国科学技术部）的规                            湿盒内。细胞核加 DAPI 染液复染后封片，倒置荧
                定执行。所有动物实验均经南京医科大学实验动                             光显微镜（Eclipse Ti⁃SR，Nikon 公司，日本）下观察
                物福利伦理委员会批准，旨在最大程度地减少痛苦                            细胞并采集图像，并通过HALO 软件计算出TUNEL
                并减少所用动物的数量。                                       阳性细胞的百分比        ［13-14］ 。
                1.2.2 小鼠行为学检测                                     1.2.5 蛋白质免疫印迹
                    在进行基线测试之前，将小鼠置于测试环境至                              取出小鼠膝关节软骨，蛋白提取试剂盒提取蛋
                少 3 d 以适应测试环境。使用 Von Frey 纤维丝测定                   白，并测定蛋白质浓度。蛋白质经10%十二烷基硫酸
                小鼠后爪机械缩足反射潜伏期阈值，用以评价小鼠                            钠中凝胶电泳，4 ℃ 100 V 转移1.5 h至硝酸纤维素膜
                的疼痛行为。测试时，首先将小鼠放入金属网地板                            上。用5%脱脂奶粉溶液在室温下封闭1 h，然后加入
                的盒子中，使其适应 30 min。将标准的 Von Fery 纤                  相应一抗Bcl⁃2、Bax、cleaved caspase⁃9和caspase⁃9，
                维丝（0.008 g、0.02 g、0.04 g、0.07 g、0.16 g、0.4 g、     4 ℃孵育过夜。第2天洗膜后，与相应二抗在常温下
                0.6 g、1.0 g、1.4 g和2.0 g）刺激小鼠左后爪的足底表               孵育1 h。显色、成像，并使用Image J（2.0）分析软件
                面，直到纤维弯曲，记录所用Von Fery纤维丝提供的                       对条带灰度分析，计算蛋白质的相对表达量。
                刺激力。对每只小鼠进行 3 次测试，计算测量阈值                          1.3 统计学方法
                的平均值。当小鼠表现出对≤0.4 g 的刺激有反应                             采用 SPSS22.0 软件进行统计分析。计量资料
                时，则判定为异常，正常小鼠的阈值在1~2 g 。                          以均数±标准差（x ± s）表示，组间比较采用单因素方
                                                      ［10］
                1.2.3 组织学分析                                       差分析，组间两两比较采用 SNK 法。P < 0.05 为差
                    新鲜获得的整个小鼠左后膝关节迅速固定在                           异有统计学意义。
                4%多聚甲醛中，常规脱钙、脱水后用石蜡包埋固
                                                                  2  结 果
                定。标本切片、脱蜡后，分别用甲苯胺蓝染色和番
                红固绿染色。                                            2.1  Nic对OA模型小鼠关节疼痛的影响
                    甲苯胺蓝染色时，标本先用甲苯胺蓝溶液浸泡                              如图 1 所示，MIA 给药后 1~3 周，小鼠的运动功
                30 min，清洗后置于冰醋酸溶液中，蒸馏水清洗2次，                       能受到明显影响，引起机械性痛觉超敏，痛阈下降，
                随后逐级乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。                            第 1 周 MIA 组小鼠机械缩足反射潜伏期阈值为
                由两位病理学医师依据评分标准在光学显微镜下观                           （0.21 ± 0.04）g，较正常对照组下降 80%，持续至第
                察软骨病变、软骨下糖胺聚糖改变并对甲苯胺蓝染色                           3 周MIA组机械缩足反射潜伏期阈值仍较对照组下
                标本进行评分，取两者平均分为最后得分。                               降约 69%（P < 0.05）；而给予 Nic 进行预处理，能显
                    番红固绿染色时，标本用 l％番红染液浸染3 min，                    著增加小鼠的运动功能评分，其中 1.0 mg/kg Nic 较
                1％固绿复染3 min，95％酒精分化数秒，复加番红染                       0.5 mg/kg Nic效果更为明显，Nic预处理21 d后，小鼠
                色2 min，镜下95％酒精分化数秒，随后逐级乙醇脱                        机械缩足反射潜伏期阈值可恢复至（1.08 ± 0.09）g，接
                水、二甲苯透明、中性树胶封固。根据关节软骨退变                           近对照组水平（P > 0.05），表明Nic能减轻MIA引起
                评分和蛋白聚糖损失评分标准分别在光学显微镜下                            的疼痛行为。同时，选择性的α7⁃nAChR 拮抗剂
                观察软骨病变      ［11-12］ ，对番红固绿染色标本评分，取两               MLA（1.0 mg/kg）能取消 Nic 对 MIA 模型小鼠的镇痛
                者平均分为最后得分。                                        作用，MLA组小鼠机械缩足反射潜伏期阈值显著下
                1.2.4 石蜡切片荧光TUNEL实验                               降至（0.25 ± 0.04）g，与 Nic 预处理组比差异有统计

                    试剂盒采用 Fluorescein（FITC）Tunel Cell Apop⁃       学意义（P < 0.05），表明 Nic 可能是通过α7⁃nAChR
                tosis Detection Kit（G1501⁃50T，Servicebio 公司，美     发挥镇痛作用。
                国），按试剂盒说明书应用 TUNEL 染色评估凋亡细                        2.2  Nic对MIA诱导的小鼠关节软骨退化及细胞凋

                胞数量。依次将石蜡切片脱蜡水洗后，用蛋白酶 K                           亡的影响
                工作液覆盖组织，然后用PBS（pH7.4）在脱色摇床上                           关节内注射0.1 mg/10 μL MIA可诱发膝关节软
                晃动洗涤 3 次，每次 5 min，切片稍甩干后在圈内滴                      骨退化，甲苯胺蓝和番红固绿染色（图2A）显示MIA组
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