Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第9期
·1306 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年9月

过夜后，分别加入浓度为 0、40、80、120 μg/mL 的重 1A）。纯化后的PCR片段经NdeⅠ、HindⅢ酶切后与
组蛋白 Pec1 刺激 24 h。铜绿假单胞菌 PAO1 在 LB pMD19⁃T质粒连接，转化E.coli DH5a感受态细胞，提
培养基 37 ℃振荡培养过夜后，90 ℃水浴灭活 1 h， 取阳性克隆进行双酶切鉴定，可看到大小约3 520 bp
PBS洗涤3次，用PI标记灭活的PAO1，离心洗涤3次 的重组pMD19⁃T⁃pec1质粒条带、2 692 bp的pMD19⁃T
后，PBS悬浮灭活菌沉淀，以MOI 100∶1比例加入灭 质粒条带和828 bp的基因Pec1条带，与理论值相符
活的细菌悬液500 μL/孔，细胞吞噬15 min后，PBS漂 （图 1B）。 重 组 pET ⁃ 30a ⁃ pec1 表 达 载 体 是 重 组
洗3次，AO染色细胞15 min，用荧光显微镜随机选取 pMD19⁃T⁃pec1 质粒经 NdeⅠ、HindⅢ酶切后插入至
5个视野拍照，采用Image J软件定量分析。 pET⁃30a质粒、转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞所

1.3 统计学方法 得，图中可见5 422 bp的pET⁃30a质粒条带和828 bp
采用SPSS 25.0软件进行统计分析，实验数据以 的基因 Pec1 条带（图 1C），与预期相符，且测序结果
均数±标准差（x ± s）表示，每个实验单独重复 3 次， 与 NCBI 的数据库比对一致，提示重组表达载体构
两组间比较用 t 检验，多组间比较使用单因素方差 建成功。
分析（one⁃way ANOVA），并进行线性趋势检验，P＜ 2.2 重组蛋白Pec1的诱导表达与纯化
0.05为差异具有统计学意义。 将经IPTG诱导后的菌液裂解、镍亲和层析柱分
离纯化后的上清进行SDS⁃PAGE分析，结果显示明显
2 结 果
目的条带，大小约30.5 kDa，与预期结果相符（图2）。
2.1 Pec1基因的扩增与质粒构建 2.3 Pec1对MH⁃S细胞增殖的影响
经PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离 采用CCK⁃8法检测重组蛋白Pec1对MH⁃S细胞
后，显示的条带与预期一致，大小约 828 bp（图 增殖的影响。结果显示，分别用不同浓度的Pec1刺

A B C
M 1 M 1 2 M 1

5 000 bp 5 000 bp
3 000 bp 4 000 bp
3 000 bp 10 000 bp
2 000 bp 8 000 bp
2 000 bp -2 692 bp 6 000 bp
1 000 bp 1 000 bp 5 000 bp 5 422 bp
-828 bp 4 000 bp
750 bp 750 bp -828 bp 3 000 bp
500 bp
500 bp 2 000 bp
250 bp 250 bp
1 000 bp
100 bp 828 bp
750 bp
A：Pec1基因的扩增。M：DNA marker；1：扩增的Pec1的基因片段；B：重组pMD19⁃T⁃pec1质粒的酶切鉴定。M：DNA marker；1：重组pMD19
⁃T⁃pec1 质粒；2：重组 pMD19⁃T⁃pec1 质粒经 Nde Ⅰ、HindⅢ双酶切；C：重组 pET⁃30a⁃pec1 表达载体的酶切鉴定。M：DNA marker；1：重组 pET⁃
30a⁃pec1表达载体经Nde Ⅰ、HindⅢ双酶切。
图1 重组质粒pMD19⁃T⁃pec1及pET⁃30a⁃pec1的构建
Figure 1 Construction of the plasmid pMD19⁃T⁃pec1 and pET⁃30a⁃pec1

激细胞后，在24、48、72 h 3个时间点观察，随着刺激 2.5 荧光显微镜观察结果
浓度的增加，重组蛋白Pec1对MH⁃S细胞增殖的抑制 荧光显微镜下观察经 PI 标记的灭活 PAO1（图
作用越明显，差异有统计学意义（P < 0.05，图3）。 5A），与对照组相比，40、80、120 μg/mL 的 Pec1 蛋白

2.4 Pec1对MH⁃S细胞吞噬中性红功能的影响 刺激 MH⁃S 细胞后，加入灭活 PAO1 吞噬 30 min，随
不同浓度的 Pec1 刺激 MH⁃S 细胞 24 h 后，检测 着刺激浓度的增高，吞入胞内的灭活菌逐渐减少，
细胞吞噬中性红的能力。结果表明，0（对照组）、 且胞内相对荧光定量差异具有统计学意义（图 5B，
40、80、120 μg/mL Pec1 处 理 的 吞 噬 指 数 分 别 为 P < 0.001）。
1.00±0.04、0.82±0.02、0.04±0.01、0.03±0.01，表明随
3 讨 论
着 Pec1 浓度的增大，MH⁃S 细胞吞噬中性红能力逐
渐下降，差异具有统计学意义（P < 0.01，图4） 单核/巨噬细胞和中性粒细胞是机体发挥吞噬