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第41卷第9期          张文思，朱文卿，邱 憬. 纯钛表面复合胶原蛋白凝胶涂层改性及其生物学性能初探［J］.
                  2021年9月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1329-1335                      ·1331 ·


                800 目、1 200 目、1 500 目）逐级打磨抛光，依次置于                 吸光度值越高表示细胞增殖活性越高。
                双蒸水、无水乙醇、双蒸水中超声清洗10 min，60 ℃                      1.2.6  碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性
                干燥，高压灭菌。                                          检测
                    钛表面Ⅰ型胶原蛋白涂层改性试件（cp⁃Ti⁃                            微板法检测：两组试件预置于 6 孔板中，将
                                                                                     4
                col）：根据说明书采用冰醋酸调节Ⅰ型胶原蛋白pH                         MC3T3⁃E1细胞（8×10 个/孔）接种于试件表面，进行
                为中性，用去离子水与Ⅰ型胶原蛋白混合，经过                             成骨诱导，培养7、14 d后，弃培养基，PBS清洗，每孔
                37 ℃温度变化，胶原蛋白自组装为胶原纤维形成凝                          加入200 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，收集裂
                胶，配制1 mg/mL的Ⅰ型胶原蛋白凝胶后，置于光滑                        解细胞，4 ℃ 12 000 r/min 离心 10 min，收集上清
                钛试件表面制成涂层，经过 5 h 紫外线照射使胶原                         液。使用 BCA 试剂盒和 ALP 试剂盒测定蛋白浓度
                纤维凝胶再次发生交联           ［14］ ，胶原蛋白涂层重度脱水             和ALP值，评估各组试件表面ALP活性。
                后具有良好的抗胶原酶解能力，降低了胶原的水溶                                染色法检测：两组试件预置于 6 孔板中，将
                性，有利于提升其生物相容性。                                    MC3T3⁃E1细胞（8×10 个/孔）接种于试件表面，培养
                                                                                     4
                1.2.2 钛表面理化性能表征                                   7、14 d后，PBS 清洗，用4%福尔马林固定30 min，使
                    两组试件制备完成后，采用扫描电子显微镜                           用 5⁃溴⁃4⁃氯⁃3⁃吲哚基磷酸（5⁃Bromo⁃4⁃Chloro⁃3⁃In⁃
               （scanning electron microscopy，SEM）观察试件的表           dolyl Phosphate，BCIP）/硝基蓝四唑（Nitrobluetetrazo⁃

                面微形貌；采用 X 射线光电子能谱仪（X⁃ray photo⁃                   lium chloride，NBT）碱性磷酸酶染色 30 min。再次
                electron spectroscopy，XPS）分析试件的表面元素组              在PBS中洗涤样品，比较各组ALP染色强度。
                成；采用红外光谱测试仪（fourier transform infrared            1.2.7 Western blot检测成骨相关蛋白表达
                spectrometer，FT⁃IR），在波长 400~4 000 cm 范围内              两组试件预置于 6 孔板中，将 MC3T3⁃E1 细胞
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                检测试件表面的基团；采用 SL200B 型自动接触角                       （8×10 个/孔）接种于试件表面，培养7、14 d后，提取
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                仪，将2 μL水滴于试件表面，测量水接触角，评估试                         细胞总蛋白，加热变性后-20 °C保存。 BCA蛋白检
                件的表面亲水性。                                          测试剂盒测定蛋白浓度。Western blot 检测细胞中
                1.2.3 成骨细胞体外培养                                    Runx2、OSX、OCN 的蛋白表达水平，以 GAPDH 为
                    复苏冻存的小鼠 MC3T3⁃E1 成骨细胞，采用含                     内参。
                10%胎牛血清、1%青⁃链霉素的α⁃MEM 培养基，在                       1.3  统计学方法
                37 ℃、95% 相对湿度、5% CO2细胞恒温培养箱内静                         采用 SPSS 22.0 软件对细胞增殖活性和 ALP 活
                置培养。定期传代，采用 3 次传代后 24 h 的细胞进                      性数据进行统计分析，两组数据经方差齐性检验后采
                行实验。当细胞密度达 80%~90%后用 0.25%胰蛋                      用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                白酶/EDTA消化，离心后重悬，计数并分离细胞。
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                1.2.4 成骨细胞黏附观察
                    将 MC3T3⁃E1 细胞（5×10 个/孔）接种于两组试                 2.1  钛表面形貌观察
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                件表面。分别培养 2 h 和 4 h 后，室温下 4%多聚甲                        cp⁃Ti、cp⁃Ti⁃col 试件表面形貌和扫描电镜观察
                醛固定 30 min，罗丹明标记的鬼比环肽室温下避光                        图像见图1。经过物理改性后的Ⅰ型胶原蛋白在钛
                染 色 30 min，PBS 清 洗 后 ，DAPI 室 温 避 光 染 色            表面发生交联，形成稳定均匀的胶原蛋白凝胶涂

                2 min。激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning            层。扫描电镜低倍和高倍视野显示，cp⁃Ti试件表面
                microscope，CLSM）下随机选取视野，观察两组试件                    有清晰的机械划痕，而 cp⁃Ti⁃col 试件表面由于胶原
                表面的细胞黏附形态。                                        蛋白涂层的存在使得机械划痕变浅。
                1.2.5 成骨细胞增殖活性检测                                  2.2  钛表面元素组成和特征基团
                    采用 CCK⁃8 法检测两组试件表面成骨细胞的                           两组试件表面的XPS元素分析和FT⁃IR检测结
                增殖活性。分别将两组试件置于 96 孔板中，将                           果见图 2。与 cp⁃Ti 试件比较，cp⁃Ti⁃col 试件表面存
                MC3T3⁃E1细胞（5×10 个/孔）接种于试件表面，每组                    在明显的氮（N）元素特征峰，且由于胶原蛋白涂层
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                设 4 个复孔，培养 1、3、6 d 后，每孔加入 200 μL 含                的存在，未检测出钛（Ti）元素（图2A）。在胶原蛋白改
                10％CCK⁃8试剂的新鲜培养基，继续孵育2 h后，采用                      性过程中，只有蛋白质或多肽含有N元素。cp⁃Ti⁃col
                微孔板分光光度计测定各孔450 nm 处的吸光度值。                        试件表面在 3 400 cm 附近呈现蛋白质的特征吸收
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