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南京医科大学学报（自然科学版） 第41卷第9期
·1336 · Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences） 2021年9月

·基础研究·

荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测 CAR⁃T 细胞杀

伤的方法学研究

吴亚松 1，2* ，李 薇 ，朱 毅 ，李 东 1*
3，4
2
南京医科大学附属明基医院输血科，江苏 南京 210003；湖南师范大学附属第一医院血液科，湖南 长沙 410005；南京
1 2 3
医科大学第一附属医院胰腺中心，普外科，江苏 南京 210009
4

［摘 要］ 目的：比较荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法两种杀伤实验方法在嵌合抗原受体T（chimeric antigen recep⁃
tor⁃T，CAR⁃T）细胞针对不同性质靶细胞开展杀伤实验时的适用性。方法：针对两种不同性质的靶细胞（悬浮细胞和贴壁细
胞），采用荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法开展 CAR⁃T 细胞的杀伤实验，比较实验结果的精确性和趋势的一致性。
结果：荧光染料双染流式法在靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验中能检测到具有统计意义的显著杀伤（P < 0.01），但在靶细胞为贴
壁细胞的实验中差异不显著；萤火虫荧光素酶法在悬浮和贴壁两种靶细胞的杀伤实验中都能检测到显著的杀伤（P < 0.01）。
结论：荧光染料双染流式法更适合靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验，而萤火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴壁细胞都适合，因此在
具体应用过程中应注意区别对待。
［关键词］ CAR⁃T细胞；杀伤实验；荧光染料双染流式法；萤火虫荧光素酶
［中图分类号］ R392.33 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2021）09⁃1336⁃06
doi：10.7655/NYDXBNS20210910

嵌合抗原受体 T（chimeric antigen receptor⁃T，
1 材料和方法
CAR⁃T）细胞在针对B细胞急性淋巴细胞白血病 ［1-2］
和B细胞淋巴瘤 ［3-4］ 的临床试验中取得了巨大成功， 1.1 材料
彻底改变了血液肿瘤的治疗方法，为相应疾病的患 人淋巴瘤细胞系 Raji 细胞和人白血病细胞系
者提供了新选择。在 CAR⁃T 细胞治疗技术的研发 K562细胞购自中国典型培养物保藏中心细胞库，表
过程中，细胞杀伤实验是非常关键的验证手段，此 达 luciferase 基因的 Raji⁃luc 细胞和表达人 CD19 基
实验用CAR⁃T细胞与靶细胞以一定比例共培养，特 因的K562⁃CD19细胞为本实验室构建；Malme⁃3m细
定时长之后用特定的方法检测靶细胞的死亡比例， 胞购自南通表源生物技术有限公司，表达人 CD19
即可以用靶细胞的死亡率来表示 CAR⁃T 细胞的杀 和luciferase基因的Malme⁃3m⁃CD19⁃luc细胞为本实
1
伤能力。靶细胞死亡率的检测方法中，传统的 5 Cr 验室构建；人外周血单个核细胞（peripheral blood
［5］
（铬51）释放实验需要专门的放射性检测仪器 ，而铕 monouclear cell，PBMC）来自天津市血液中心，CD19⁃
元素（Europium）标记、乳酸脱氢酶（lactate dehydro⁃ CART细胞为本实验室构建。
genase，LDH）代谢产物等检测方法具有较高的检 DMEM 培养基（C11995500BT，Gibco 公司，美
测背景，导致信噪比较低 ［6-7］ ，因此我们建立并比 国）；胎牛血清（FSP500，Excell 公司，美国）；Calcein⁃
较了荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法两 AM（货号 C131116⁃1mg，上海阿拉丁生化科技股份
种方法，希望以此验证这两种方法的有效性与适 有限公司）；CellTracker DeepRed Dye（货号 C34565，
用条件。 Invitrogen 公司，美国）；D⁃Luciferin（货号 7902⁃1G，
BioVision 公司，美国）；ATP（货号 A100885，上海阿
拉丁生化科技股份有限公司）；PBS（SH30256.01，
［基金项目］ 南京市医学科技发展一般性课题（YKK18226）；
湖南省自然科学基金面上项目（2020JJ4403） HyClone公司，美国）；0.25%Trypsin（25200⁃072，Gib⁃
∗ co 公司，美国）；二氧化碳培养箱（Thermo 公司，美
通信作者（Corresponding author），E⁃mail： wuyasong1231@163.
com；Linda.D.Li@benqhospital.com 国）；生物安全柜（Thermo Scientific 1300 Series A2，