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第41卷第9期 吴亚松，李 薇，朱 毅，等. 荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测CAR⁃T细胞杀伤的
2021年9月 方法学研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1336-1341 ·1337 ·

Thermo公司，美国）；小动物活体成像系统（IVIS Lu⁃ 限的右上角，双阴性的效应细胞在象限的左下角。
mina Ⅲ，Caliper 公司，美国）；流式细胞仪（Guava 杀伤效率计算公式为：（靶细胞密度值阳性对
EasyCyte，Millipore公司，美国）。 照-靶细胞密度值实验组）/靶细胞密度值阳性对照×
1.2 方法 100%。
1.2.1 靶细胞系构建 1.2.4 萤火虫荧光素酶法检测细胞杀伤
pRL⁃luciferase、pRL⁃hCD19、pRL⁃hCD19⁃lucifer⁃ 萤火虫荧光素酶法是利用萤火虫荧光素酶
ase 3 个质粒分别与 pCMV⁃VSV⁃G 和 pCMV⁃dR8.91 （Firefly luciferase，下文简称“luc”）的化学发光特性，
2 个包装质粒共转染293⁃T细胞，收获的病毒上清经 用基因工程方法构建表达 luc 的靶细胞，在杀伤实
20 倍 浓 缩 后 ，分 别 感 染 Raji 细 胞 、K562 细 胞 和 验检测时加入 luc 的发光底物后，即可通过发出的

Malme⁃3m细胞，经流式细胞术分选纯化后，得到Raji⁃ 荧光信号的强弱来显示活细胞数目，以此来计算杀
luc、K562⁃CD19、Malme⁃3m⁃CD19⁃luc 3 个细胞系作 伤效率 ［11-12］ 。具体方法为：用表达luc的细胞作为靶
为杀伤实验的靶细胞。 细胞，以 1×10 个/孔的密度接种于 96 孔板中，实验
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1.2.2 CAR⁃T细胞的制备与培养 组将 CD19⁃CART 细胞以 1∶1、5∶1、10∶1、20∶1 的细

用 CD19⁃CAR 质粒与 pCMV⁃dR8.91 和 pCMV⁃ 胞量分别加入到各个靶细胞孔中，每孔终体积为
VSV⁃G 2个包装质粒按照4∶3∶1的比例，用PEI共转 200 μL，阳性对照为只有靶细胞且不加 CAR⁃T 细
染293⁃T细胞，转染后48 h收获病毒上清，经超速离心 胞，用培养基补足体积至 200 μL，阴性对照为靶细
后换T细胞培养基（X⁃VIVO15+0.5%HSA）进行20倍 胞加50 μL 2%Triton X⁃100溶液裂解，所有孔混匀后
浓缩。人PBMC细胞经Ficoll分离后加100 ng/mL可 放置 CO2培养箱 37 ℃孵育约 16 h。孵育过后，首先
溶性 CD3 抗体（OKT3）和 300 U 白细胞介素（inter⁃ 每孔加入 50 μL 2%的 Triton X⁃100 溶液，用移液器
leukin，IL）⁃2 刺激，48 h 后换液加入病毒 32 ℃ 300 g 混匀后每孔取出 50 μL，加入到检测用的黑色 96 孔
离心90 min感染，感染后24 h换新鲜T细胞培养基， 板中，再向黑色96孔板中每孔加入50 μL的底物溶
CAR⁃T细胞培养到第7天即可作为效应细胞开展杀 液（300 μg/mL D⁃Luciferin 水溶液与 2 mg/mL ATP
伤实验。 水溶液按照体积比为 3∶1 混和），用移液器混匀后
1.2.3 荧光染料双染流式法检测细胞杀伤 静置5 min，上机检测。检测仪器可用多功能酶标仪
荧光染料双染流式法是用两种不用的荧光染 或活体成像仪。
料标记靶细胞，在与效应细胞共培养后检测杀伤的 杀伤效率计算公式为：［（荧光强度阳性对照-
方法，在流式细胞仪上检测双荧光细胞的减少确定死 荧光强度阴性对照）-（荧光强度实验组-荧光强度
亡细胞，并计算杀伤效率 ［8-10］ 。具体方法为：在1 mL T 阴性对照）］/（荧光强度阳性对照-荧光强度阴性
细胞培养基（X⁃VIVO15+0.5%HSA）中加入1×10 个 对照）×100%。
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Raji 细胞，加入 Calcein⁃AM 至终浓度 2 nmol/L，加入 1.3 统计学方法
CellTracker DeepRed Dye 至终浓度0.1 μmol/L，混匀 用SPSS20.0统计软件进行数据处理，采用涉及
后37 ℃避光孵育30 min，孵育完成后用PBS洗3次， 两组数据间的比较时统计方法采用 Student⁃t 检
以 1×10 个/孔的密度接种于 96 孔板中。实验组取 验。涉及3组及以上数据间的比较时统计方法为单
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CD19⁃CART 细胞，PBS 洗 1 遍后重悬于 T 细胞培养 因素方差分析，用 LSD 法进行多重比较。P < 0.05
基中，以1∶1、5∶1、10∶1的细胞量分别加入到对应的 为差异有统计学意义。
Raji细胞孔中，每孔终体积为200 μL，阳性对照组不
2 结 果
加 CD19⁃CART 细胞，用 T 细胞培养基补足体积至
200 μL。所有孔混匀后放置CO2培养箱37 ℃孵育约 2.1 荧光染料双染流式法在悬浮细胞杀伤实验中
4 h，孵育完成后即可直接用流式细胞仪检测。 的效果

使用的染料包括一种绿色荧光染料Calcein⁃AM 为了验证荧光染料双染流式法检测杀伤实验
和一种红色荧光染料 CellTracker DeepRed Dye，两 的效果，用靶向 CD19 的 CD19⁃CAR 病毒感染人的
个染料都可以对活的靶细胞均匀染色，用流式细胞 PBMC 制备了 CD19⁃CART，经流式细胞术验证，其

仪可以检测到显著的阳性。设置流式检测象限的X CD3阳性率大于90%，其CAR阳性率可达39.5%（图
轴为Red⁃R，Y轴为Green⁃B，则双阳性的靶细胞在象 1A），将此 CD19⁃CART 细胞与 CD19 阳性的 Raji 细