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第41卷第9期 吴亚松，李 薇，朱 毅，等. 荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测CAR⁃T细胞杀伤的
2021年9月 方法学研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1336-1341 ·1339 ·

A 9 000 0.00% Control 0.00% 9 000 0.00% antiCD3⁃FITC 0.00% （ GRN⁃B⁃HLog） 10 5 0.04% 0.08% （ GRN⁃B⁃HLog） 10 5 0.02% 0.08%
CD19⁃Fc+G&H⁃DY650
IgG+G&H⁃DY650
（ SSC⁃HLin） 7 000 R2 （ SSC⁃HLin） 7 000 R2 10 4 3 10 4 3
10
10
5 000
5 000
Side Scatter 3 000 99.61% 0.39% Side Scatter 3 000 8.30% 91.70% Fluorescence 10 2 1 95.40% R2 4.48% Fluorescence 10 2 1 55.94% R2 43.96%
10
10
1 000
1 000
0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Green⁃B 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Green⁃B 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Green⁃B Fluorescence Green⁃B Fluorescence Red⁃R Fluorescence Red⁃R Fluorescence
（GRN⁃B⁃HLog） （GRN⁃B⁃HLog） （RED⁃R⁃HLog） （RED⁃R⁃HLog）
B C
* Raji cell Calcein⁃AM Calcein⁃AM+Celltracker
6 000 * （ RED⁃R⁃HLog） 10 5 0.00 cell/mL 0.00 cell/mL （ RED⁃R⁃HLog） 10 5 19.28 19.28 （ RED⁃R⁃HLog） 10 5 1.20E+05 cell/mL
（ pg/mL） 4 000 10 4 3 10 4 3 cell/mL cell/mL 10 4 3
IFN⁃γ 2 000 10 2 R2 10 2 R2 10 2
10
10
10
0 Fluorescence 10 1 9.76E+ Fluorescence 10 1 5 264.60 1.06E+ Fluorescence 10 1
T cell+Raji
CD19⁃CAR⁃T+Malm⁃3m Red⁃R 10 0 10 0 10 1 10 0.00 cell/mL 4 Red⁃R 10 0 10 cell/mL 1 10 2 05 cell/mL 10 4 Red⁃R 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
CD19⁃CAR⁃T+Raji
05 cell/mL
3
0
3
2
10
10
10
10
Green⁃B Fluorescence
（GRN⁃B⁃HLog）
（GRN⁃B⁃HLog） Green⁃B Fluorescence Green⁃B Fluorescence
（GRN⁃B⁃HLog）
D
6 5 y=0.257x+0.192 10 5 1×CD19⁃CART 10 5 5×CD19⁃CART 10 5 10×CD19⁃CART
（ ×10 5 ） 4 3 R =0.999 （ RED⁃R⁃HLog） 10 4 8.94E+04 cell/mL （ RED⁃R⁃HLog） 10 4 4.80E+04 cell/mL （ RED⁃R⁃HLog） 10 4 2.77E+04 cell/mL
2
读数 2 1 10 3 10 3 10 3
0 10 2 10 2 10 2
0 5 10 15 20 25 Fluorescence Fluorescence Fluorescence
细胞数（×10） 10 1 10 1 10 1
5
Red⁃R 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Red⁃R 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Red⁃R 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
Green⁃B Fluorescence Green⁃B Fluorescence Green⁃B Fluorescence
（GRN⁃B⁃HLog） （GRN⁃B⁃HLog） （GRN⁃B⁃HLog）
E 100 ** F 100 T cell G 100 ** H 100 T cell
（ % ） 80 ** * （ % ） 80 ** *** ** （ % ） 80 *** *** （ % ） 50 CD19⁃CART P=0.47
CD19⁃CART
细胞杀伤 40 ** Raji细胞杀伤 40 K562⁃CD19 细胞杀伤 40 T cell Malme⁃3M⁃CD19 细胞杀伤 0 P=0.94 P=0.92 20∶1
60
60
60
20
20
20
5∶1
10∶1
0 0 0 CD19⁃CART -50 效靶比
0 1∶1 5∶1 10∶1 20∶1 5∶1 10∶1 20∶1 5∶1 10∶1 20∶1
效靶比 效靶比 效靶比
A：CD19⁃CART细胞用antiCD3⁃FITC检测CD3阳性率，用CD19⁃Fc作为一抗，G&H⁃DyLight650作为二抗检测CAR阳性率；B：CD19⁃CART
细胞与Raji细胞按照10∶1的比例共孵育2 h后检测IFN⁃γ，实验组与两个对照组相比均具有显著性差异（n=3，统计方法为单因素方差分析后
LSD法多重比较，两组比较，P < 0.01）；C：Raji细胞用Calcein⁃AM和CellTracker DeepRed Dye 染色后，流式图显示单染、双染、及加入不同比例
*
的CD19⁃CART细胞后的散点图分布；D：用图C左下象限检测到的效应细胞密度值与效应细胞的加入量做标准曲线；E：用图C右上象限检测
到的靶细胞密度值计算出的杀伤效率；F：CD19⁃CART细胞对Raji细胞的杀伤实验结果，每个效靶比条件下的CD19⁃CART与对照T细胞的杀
伤效率均具有显著性差异；G：CD19⁃CART细胞对K562⁃CD19细胞的杀伤实验结果，每个效靶比条件下的CD19⁃CART与对照T细胞的杀伤效
率均具有显著性差异；H：CD19⁃CART细胞杀Malme⁃3m⁃CD19细胞的杀伤实验结果，各个效靶比条件下的实验组与对照组均不具有显著性差
异。（E、F、G的统计方法为Student⁃t检验，n=3，两组比较，P < 0.05，P < 0.01， P＜0.001）。
***
**
*
图1 荧光染料双染流式法可检测CAR⁃T细胞对悬浮细胞的杀伤实验
了相同数量的 T 或 CAR⁃T 细胞，我们认为这种统一 法，并比较了在靶细胞为悬浮细胞和贴壁细胞时这
的背景变化不会影响最终的杀伤结论。 两种方法的可行性和优缺点，结果显示荧光染料双
综上所述，本研究建立了荧光染料双染流式法 染流式法仅适用于悬浮细胞的杀伤实验，不适用于
和萤火虫荧光素酶法两种 CAR⁃T 杀伤实验检测方 贴壁细胞的情况；而萤火虫荧光素酶法在靶细胞为