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第41卷第9期
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              胞共孵育可检测到 IFN⁃γ释放的显著提高（图 1B），                      入的CD19⁃CART细胞的增加，杀伤效率呈显著增高
              证明此CD19⁃CART细胞具有针对CD19阳性细胞的                       趋势（图2E）。
              杀伤能力。                                                  用此方法开展 CD19⁃CART 细胞及其对照T细
                  为了观察细胞数目而非相对的比例，需要将流                          胞对悬浮的Raji⁃luc细胞和贴壁的Malme⁃3m⁃CD19⁃
              式参数设置为显示细胞浓度，这样所有样品收集等                            luc（表达 CD19 和 luciferase 的 Malme⁃3m 细胞）的杀
              体积的上样量，即可得到相应目的细胞的浓度数值                            伤实验，结果显示CD19⁃CART细胞对两种靶细胞的
             （图 1C）。为了验证流式方法检测细胞数量的准确                           杀伤都显著高于其对照 T 细胞，差异有统计学意义
              性，我们用效应细胞的剂量梯度与流式读数做标准                            （图2E、F），因此萤火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴
              曲线，结果显示了很好的线性关系（图1D）。杀伤效                          壁细胞的杀伤实验都适用。
              率随着 CD19⁃CART 效应细胞的增多而增高的趋势
                                                                3  讨 论
             （图1E）。
                  CD19⁃CART细胞作为效应细胞，并用感染对照                           CD19⁃CART 细胞治疗已经成为复发/难治性 B
              病毒的同批次培养T细胞作对照，用上述“荧光染料                           细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的最优疗法，其完全
              双染流式法”开展了以 Raji 细胞和表达 CD19 的                      缓解率甚至可为50%~90%，由此引起了学术界极大
              K562细胞（K562⁃CD19）为靶细胞的杀伤实验，结果                     的兴趣，催生了大量的 CD19 和非 CD19 靶向性的
              显示 CD19⁃CART 细胞对两种悬浮靶细胞的杀伤都                       CAR⁃T 研究   ［13-15］ ，所针对的疾病除了血液系统肿瘤
              高于其对照T细胞，差异具有显著性（图1F、G）。                          外，还包括多种实体瘤等           ［16-17］ ，而所有这些研究都需
                  鉴于有些杀伤实验会用到贴壁细胞作为靶细                           要细胞杀伤实验来证明其有效性。传统的 5 Cr 释
                                                                                                         1
              胞，我们用黑色素瘤细胞系 Malme⁃3m 构建了表达                       放、Europium 标记、LDH 代谢产物等杀伤实验检测
              CD19的贴壁细胞系Malme⁃3m⁃CD19，并用上述方法                    方法都各有缺点，难以同时兼顾便利性和准确性。
              开展了同样的杀伤实验，但结果却显示误差过大，                                 本研究比较了两种简便且准确的杀伤实验检
              CD19⁃CART 细胞与对照 T 细胞对靶细胞的杀伤效                      测方法：荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶
              率没有显著性差异（图1H），分析认为贴壁细胞若采                          法。荧光染料双染流式法不需构建特殊的靶细胞
              用此种方法会需要采用胰酶消化与吹打等操作，不                            系，只需用两种荧光染料对靶细胞染色，即可用流
              但容易造成更多的细胞损伤，而且已标记到胞内的染                           式细胞仪进行杀伤效率检测，其缺点是在使用贴壁
              料还可能外泄，进而更易产生较大误差，因此此流式                           靶细胞时会因产生过大的误差而导致实验失败；萤
              方法更适用于悬浮细胞的检测，对于贴壁细胞还需其                           火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴壁细胞都适用，可
              他更温和且更适合的方法。                                      用多功能酶标仪或活体成像仪检测，但前提是要先
              2.2  萤火虫荧光素酶法在贴壁细胞杀伤实验中的                          构建出表达荧光素酶（luc）的靶细胞。有研究者在
              效果                                                NK92细胞杀伤K562细胞这种非特异性杀伤的实验
                  为了验证荧光素酶法检测杀伤实验的效果，我                          条件下比较了这两种方法            ［18］ ，但并未开展CAR⁃T细
              们在96孔板中加入按比例稀释的靶细胞，加入底物                           胞杀伤多种靶细胞的可行性验证，本文则是在CD19⁃
              后用活体成像仪检测，拍下 96 孔板发光照片（图                          CART 细胞的特异性杀伤实验中，使用了自然表达
              2A），计算出的标准曲线（图2B），证明了此方法的准                        CD19的Raji细胞、过表达CD19的K562细胞两种悬
              确性。在加入了相等数目靶细胞 Raji⁃luc细胞的孔                       浮细胞和一种过表达 CD19 的 Malme⁃3m 贴壁细胞

              中分别加入 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍数目的 CD19⁃                  这 3 种靶细胞，实际检验了这两种方法在各个实验
              CART 细胞，加入底物后用活体成像仪检测，拍下                          条件下的表现。两种方法虽仍各有缺点，但其便利
              96 孔板发光照片（图2C、D）。由于靶细胞被杀伤后                        性和准确性得以兼顾，有望帮研究者降低进入CAR⁃
              释放出的荧光素酶降解需要一定时间，为了增加实                            T领域的门槛，促进CAR⁃T研究的发展。
              验的准确性，我们为荧光素酶法设定了更久的杀伤                                 实验中发现萤火虫荧光素酶法在低效靶比条
              孵育时间（过夜杀伤，16 h），考虑到实验组与对照组                        件下，T细胞对照组有时会出现负的杀伤结果，分析
              都经历了同样的孵育时长，我们认为细胞在此孵育                            可能是加入的T细胞通过细胞接触等机制提高了靶
              期间的增殖效应对双方是等效的，所以在此实验中                            细胞的代谢水平，进而导致了荧光素酶蛋白的表达
              默认细胞增殖不影响结果判定。结果显示，随着加                            升高。鉴于同组的T细胞或CAR⁃T细胞条件都加入
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