Page 92 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第10期
·1434 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年10月
65 ℃ 30 s,5 个循环;再 94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 1.3 统计学方法
30 s,20 个循环;最后 72 ℃ 充分延伸 5 min,10 ℃保 采用 SPSS 26.0 统计学软件进行数据处理。采
温。初次PCR结束后进行第二轮扩增,引入Illumina 用mothur软件计算生物多样性指数,并利用R 3.6.0
桥式 PCR 兼容引物,扩增体系采用 30 μL:2×Hieff ® 软件制作 Chao1 指数和 Shannon 指数的差异检验箱
Robust PCR Master Mix 15 μL,引物各 1 μL,PCR 产 线图以及PcoA主坐标分析图。采用STAMP 2.1.3软
物 10~20 ng,灭菌双蒸水 9~12 μL,反应条件:95 ℃ 件对不同喂养组间的差异类群进行分析。对于符
预变性 3 min;然后94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s, 合正态分布的连续型变量,采用均数±标准差(x ± s)
5 个循环;再 72 ℃充分延伸 5 min,10 ℃保温。所得 进行描述,对于不符合正态分布的连续型变量,采
PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测质量。 用中位数(四分位数)[M(P25,P75 )]进行描述;对于
1.2.3 文库构建及上机测序 分类变量,采用频数和百分数进行描述。对于满足
TM
使用 Yeasen 公司的 Hieff NGS DNA Selection 参数检验的连续型变量,采用两独立样本 t 检验进
Beads 建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库 行组间比较或采用配对 t 检验进行组内前后比较;
使用 Qubit3.0 荧光定量仪进行文库浓度测定,合格 对于不满足参数检验的连续型变量,采用 Wilcoxon
后使用Illumina Miseq /Hiseq 平台进行测序。 秩和检验进行组间比较;对于数目方差不等的两组
TM
TM
1.2.4 生物信息学分析 间比较采用Welch’s⁃t检验;对于分类资料采用χ 检
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测序所得的原始序列经过优化处理和质控 验或Fisher确切概率法检验。所有统计推断均采用
过滤后,获得优化序列。利用 Usearch 软件将优 双侧检验,检验水准α=0.05。
化序列基于 97%相似性进行聚类为操作分类单位
(operational taxonomic unit,OTU),得到 OTU 代表序 2 结 果
列后进行比对生成 OTU 表格。利用 RDP classifier 2.1 一般情况
与RDP数据库(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources. 20 例新生儿(均为阴道顺产娩出;8 例母乳喂
jsp)比对,对物种进行注释,从而获得每个 OTU 对 养,12例混合喂养)中,性别(P=1.000)、胎龄(P=0.607)、
应的物种分类信息。基于样品测序产生的 OTU 结 出生体重(P=0.281)、母孕期增重(P=0.114)及孕母
果,利用 mothur 做 rarefaction 分析;利用 R 软件绘制 年龄(P=0.625)均没有显著差异(表 1)。新生儿生
稀释曲线;利用 mothur 计算单个样本的 Alpha 多样 后 1 min、5 min 和 10 min 的 Apgar评分均为10分,参
性(OTU 数目、Chao1 指数、Shannon 指数)。在门和 与本研究的母亲和新生儿在样本采集前或采集时
属两个分类水平上统计样本的物种丰度,并行聚类 均未接受任何抗生素治疗及益生菌暴露。母孕期
分析。 均无妊娠期高血压疾病、糖尿病、感染等并发症。
表1 两组新生儿临床基本情况的比较
Table 1 Comparison of clinical basic characteristics between two groups of newborns
组别 性别(女/男,n/n) 胎龄(d,x ± s) 母孕期增重(kg,x ± s) 孕母年龄(岁,x ± s)
纯母乳喂养组(n=8) 2/6 276.63 ± 8.09 13.00 ± 3.74 29.38 ± 4.24
混合喂养组(n=12) 2/10 278.25 ± 3.62 15.83 ± 3.74 30.00 ± 4.94
P值 1.000 * 0.607 0.114 0.625
Fisher确切概率法。
*
2.2 高通量测序情况 目,292个科,736个属。
所有样本均含有可检测到的细菌 16S DNA, 2.3 细菌丰富度和多样性的特异性指数分类
40 例样本经测序共获得原始序列 2 758 724 条,经 2.3.1 样本类型的丰富度和多样性(α多样性)
过滤处理后,最终用于后续分析的有效序列为 用 Chao1 指 数 计 算 每 个 样 品 的 丰 富 度 ,用
1 847 830条,平均碱基长度(422.415±5.609)bp。序 Shannon 指数评价多样性,同时考虑相对丰富度和
列深度足以获得所有样本的高度序列覆盖(平均值 均匀度。图1显示了统计学分析指数估计口咽群落
为 0.998;中位数为 0.999;范围为 0.988~0.999)。在 的物种丰富度和多样性。由图可见,不同时点混
OTU 水平上,总共检测到 36 个门,84 个纲,144 个 合喂养组的丰富度和均匀度均高于纯乳母喂养