Page 91 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第10期 王学娟，丁诗田，高胜男，等. 不同喂养方式对早期新生儿口咽微生态菌群的影响［J］.
2022年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（10）：1432-1439 ·1433 ·

and Bacteroidetes（P=0.250）increased，but Proteobacteria decreased（P=0.055）on day 5~7 in the exclusive breastfeeding group；while
Firmicutes（P < 0.001）and Actinobacteria（P=0.733）increased，but Proteobacteria（P<0.001）and Bacteroidetes（P=0.027）decreased
in the mixed⁃feeding group. ④At the genus level，Bradyrhizobium，Staphylococcus，Acinetobacter，Burkholderia and Streptococcus were
the main genera on day 1，while with the passage of birth time，Streptococcus，Staphylococcus，Bacteroides，Rothia and Bifidobacterium
became the main genera at day 5~7. Streptococcus and Staphylococcus were the dominant genera in different feeding groups，and the
abundance of Bacteroides，Rothia，Bifidobacterium and other anaerobes in exclusive breastfeeding group was higher than that in mixed⁃
feeding group. Conclusion：The diversitly of oropharyngeal microbiota decrease gradually and the stability increased gradually in the
early life of newborns. Different feeding methods have certain effects on the colonization and distribution of oropharyngeal microbiota in
early life. Exclusive breastfeeding is helpful for the early colonization of anaerobes in the oropharynx of newborns.
［Key words］ oropharynx；microbiota；16S rRNA；newborn；breastfeeding
［J Nanjing Med Univ，2022，42（10）：1432⁃1439］

微生物定植于人体口腔、皮肤、胃肠道及呼吸 中途退出，或者拒绝进行合作。根据纳入和排除标
道等不同部位 ，通过促进黏膜结构和功能的分 准，本研究最终共纳入 20 例新生儿。本研究通过上
［1］
化，刺激先天和获得性免疫系统的发育，并提供对 海市浦东新区妇幼保健院伦理委员会批准（伦理批
病原体入侵的“定植抵抗”，为机体提供多种重要的 号：20210615B），患儿家长均知情并签署知情同意
功能 ［2-3］ 。目前的报道主要集中在肠道微生态，而对 书。纳入纯母乳喂养 8 例（exclusively breastfeeding，
于呼吸道微生态的研究相对较少，尤其是在免疫程 B）、混合喂养12例（mixed⁃feeding，M）。采集新生儿
序开始启动的生命早期。口咽经常暴露在来自上 出生当天纯母乳喂养、混合喂养的咽拭子样本标记
呼吸道和下呼吸道的微生物中，这些微生物可能代 为B1、M1，生后第5~7天纯母乳喂养、混合喂养标记
表与呼吸道疾病相关的微生物 ［4-5］ 。因此，对新生儿 的咽拭子样本为B2、M2。
口咽微生态的研究一定程度上可以预测新生儿呼 1.2 方法
吸道微生态的分布特征。另外，新生儿早期免疫程 1.2.1 样本采集
序的启动在很大程度上受到早期食物成分的影响， 由经过培训的专人负责于新生儿生后4~6 h内
因此喂养方式可以对新生儿呼吸道微生态的形成 及第 5~7 天晨起洗澡时采集咽拭子样本，采样前
产生重要影响。本研究采用 16S rRNA 基因测序技 30 min 不进食，用无菌采样拭子擦拭新生儿咽后壁
术分析足月健康新生儿早期口咽微生物群的分布 后放入无菌冻存管，避免触及唇、舌、牙龈等部位。
特征，并探讨不同喂养方式对新生儿早期口咽微生 样本采集后编号即放入-40 ℃冰箱，1周内用干冰运
物群定植的影响。 送至生工生物工程（上海）股份有限公司实验室，放
入-80 ℃冰箱保存待检测。
1 对象和方法
1.2.2 DNA 提取和聚合酶链反应（polymerase chain
1.1 对象 reaction，PCR）扩增
研究对象为2021年9月—2022年2月在上海市 采用E.Z.N.A Mag⁃Bind Soil DNA Kit 提取试剂
TM
浦东新区妇幼保健院出生的足月健康新生儿。纳 盒（厂商 OMEGA，货号 M5635⁃02）提取咽拭子样本
入标准：①胎龄≥37周，顺产娩出；②单胎；③母亲无 中微生物的总DNA，具体步骤按说明书操作。利用
吸烟、酗酒等不良嗜好；④母亲孕期无患病史及非 Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，
法药物使用史；⑤母亲无产前发热、胎膜早破、羊水 以确定 PCR 反应需加入的 DNA 量。PCR 所用的引
污染及抗生素应用史；⑥母亲在分娩前 1 个月以内 物融合了 Illumina 测序平台的 V3~V4 区段（341F：
和/或新生儿在研究期间未曾服用益生菌制剂。排 CCTACGGGNGGCWGCAG，805R：GACTACHVGGG⁃
除标准：①新生儿出生时有窒息、颅内出血、感染等 TATCTAATCC）。初次 PCR 扩增体系采用 30 μL：
病史；②新生儿存在先天畸形或遗传代谢性疾病； 2×Hieff Robust PCR Master Mix 15 μL，引物各1 μL，
®
③研究过程中出现新生儿高胆红素血症等其他需 PCR 产物 10~20 ng，灭菌双蒸水 9~12 μL，反应条
要治疗的疾病；④重要临床资料数据不全；⑤家长 件：94 ℃，预变性 3 min；然后 94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，