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第42卷第11期
               ·1532 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年11月


              5 min，95%乙醇浸泡 5 min，85%乙醇浸泡 5 min，                        表2   针对TUBA1C设计的siRNA序列
              70%乙醇中浸泡 5 min，PBS 浸洗 3 min×3 次。柠                    Table 2  Sequences of siRNA designed for TUBA1C
              檬酸钠缓冲液抗原修复，滴 3%H2O2⁃甲醇溶液灭                              名称                   序列（5′→3′）
              活内源性过氧化物酶，1%BSA 工作液封闭，滴加                             siRNA⁃1         GGGCAGUGUUUGUAGACUUTT
                                                                                   AAGUCUACAAACACUGCCCTT
              TUBA1C 一抗（1∶100 稀释，Abcam 公司，美国）。
                                                                   siRNA⁃2         AGGAAGAUGCUGCCAAUAATT
              4 ℃孵育过夜，PBS 缓冲液冲洗 3 次，滴加二抗，
                                                                                   UUAUUGGCAGCAUCUUCCUTT
              37 ℃孵育 30 min，PBS缓冲液冲洗3次。DAB反应染
                                                                   siRNA⁃3         CAGCUGUAGUUGAGCCCUATT
              色，冲洗后苏木精复染，干燥封片检测。在免疫组化
                                                                                   UAGGGCUCAACUACAGCUGTT
              染色过程中，有6例癌组织芯点和5例癌旁组织芯点
              脱片。使用显微镜（Olympus BX43）对免疫染色的切                     TAAAAGGCGCAGGGAG ⁃ 3′（反 向）。 使 用 SYBR
              片进行拍照。由两位高年资病理科医师采用12分制                           Green（One Step TB Green PrimeScript RT⁃PCR Kit
                                                                                       TM
                                                                                                  TM
              独立对每个组织位点进行半定量分析，将染色阳性细                           Ⅱ，TaKaRa 公司，日本）对扩增的基因进行标记，反
              胞百分比评为 0~4 分：0 分（<5%）、1 分（6%~25%）、                应40个循环。2       -ΔΔCt 方法用于GAPDH 和TUBA1C表
              2 分（>25%~50%）、3分（>50%~75%）和4分（>75%），              达量分析。
              将染色强度评为 0~3 分：0 分（阴性）、1 分（弱）、2 分                  1.2.4 Western blot检测蛋白表达

             （中）、3 分（强）。免疫反应性评分（immunoreactivity                     使用全蛋白抽提试剂盒提取各组乳腺癌细胞
              score，IRS）为阳性细胞的百分比评分和染色强度评                       总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取 20 μg 蛋白加入
              分的乘积。                                             SDS⁃PAGE上样孔，电泳分离后电转移至NC膜；采用
              1.2.2 细胞培养和siRNA转染                                10%BSA溶液封闭后用一抗（1∶2 000稀释，Abcam 公
                  MCF7 和 MDA⁃MB⁃231 细胞购自江苏凯基生物                  司，美国）4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入HRP标记
              技术股份有限公司。MCF7 细胞培养条件为 90%                         的二抗4 ℃孵育4 h；ECL法显色后曝光并采集图片，使
              RMPI⁃1640 培养基+10%FBS，MDA⁃MB⁃231 细胞培               用Gel⁃Pro32软件对结果进行灰度分析。
              养条件为90% L15培养基+10%FBS，37 ℃、5% CO2、                1.2.5 细胞增殖CCK⁃8检测
              饱和湿度培养箱中培养。使用 Lipofectamine 3000                       转染前将乳腺癌细胞消化、计数、配制成浓度
             （Invitrogen公司，美国）进行转染操作，过程如下：转                     为6×10 个/mL的细胞悬液，在96孔细胞培养板中每
                                                                       4
              染前1天，接种适当数量的细胞至6孔板中，使转染                           孔加入 100 μL 细胞悬液；将 96 孔细胞培养板置于
              时的细胞密度为50%~60%；用125 μL不含血清的培                      37 ℃、5% CO2培养箱中培养 24 h，根据组别进行转
              养基Opti⁃MEM稀释5 μL 20 μmol/L TUBA1C siRNA           染，同时设立阴性对照组，每组设置3个复孔；转染后
              及对照 siRNA（NC），轻轻混匀，室温孵育 5 min；用                   置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h。之后以
              125 μL 不含血清的培养基 Opti⁃MEM 稀释 5 μL                  24 h、48 h、72 h作为时间节点每孔加入10 μL CCK⁃8
              Lipofectamine 3000，轻轻混匀并室温孵育 5min；将               溶液进行CCK8分析，测定450 nm时的吸光度值。
              siRNA 稀释液和 Lipofectamine 3000 稀释液轻轻混              1.2.6 流式细胞仪分析细胞凋亡
              匀，室温孵育 20 min；将混合液加入含有细胞的                              将对数生长期的细胞消化接种到 6 孔板中，待
              750 μL 完全培养基的培养孔中，轻轻混匀，置于                         细胞贴壁后，根据组别进行转染，同时设立阴性对
              37 ℃的 5%CO2培养箱中继续培养 24 h 用于后续操                    照组，每组设置 3 个复孔；转染 24 h 后，0.25%胰酶
              作。委托江苏凯基生物技术股份有限公司构建了                             （不含EDTA）消化收集细胞；PBS洗涤细胞2次并离
              3 条靶向 TUBA1C的siRNA（表2）。                           心（1 000 r/min，5 min）收集约 5×10 个细胞；500 μL
                                                                                                5
              1.2.3 实时定量PCR检测基因表达                               的 Binding Buffer 悬浮细胞，加入 5 μL Annexin V⁃
                  使用 TRIzol 试剂（Invitrogen 公司，美国）提取各             APC 并混匀，再加入 5 μL 7⁃AAD 并混匀；室温避光
              组乳腺癌细胞的总 RNA。mRNA 逆转录引物通过                         反应10 min；流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

              Primer 6软件设计，用于基因扩增的引物GAPDH：5′                    1.3  统计学方法
              ⁃CAAATTCCATGGCACCGTCA⁃ 3′（正向），5′⁃AG⁃                   数据分析均采用 SPSS 26.0 软件。部分生物信
              CATCGCCCCACTTGATTT⁃3′（反向）；TUBA1C：5′⁃              息学分析和图像可视化采用R语言进行。计量资料
              GGGATGAGTGCTTTGTGTGC⁃3′（正向），5′⁃GTGT⁃              在统计图中以均数±标准差（x ± s）表示。计量资料
   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45