Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第11期
               ·1500 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年11月


                  自 2019 年 12 月以来，新型冠状病毒即严重急
                                                                1  材料和方法
              性呼吸综合征冠状病毒 2 型（severe acute respirato⁃
              ry syndrome coronavirus type 2，SARS⁃CoV⁃2）已经蔓     1.1  材料
              延到多个国家和地区，引发了严重的全球公共卫                             1.1.1 实验细胞
              生安全问题      ［1-2］ 。SARS⁃CoV⁃2 是一种新型β冠状病                 培养27 d的长白猪PFF细胞为本实验室留存的
              毒 ，具有高度传染性、较高隐蔽性和广泛组织趋向                           细胞。
                ［3］
              性等特征。SARS⁃CoV⁃2 为单股正链 RNA 病毒，基                    1.1.2 主要试剂与仪器
              因组约为29.9 kb，主要由２个侧翼非翻译区和整段                             pX330质粒（Addgene公司，美国）；DH5α感受态
              可编码蛋白的开放阅读框（open reading frame，ORF）               细胞、质粒抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公
              组成 。SARS⁃CoV⁃2 编码的 S 蛋白是介导病毒入                     司）；BbsⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶和T7E1酶
                  ［4］
              侵宿主细胞的关键蛋白，由 S1 和 S2 两个亚基组                        （New England Biolabs 公司，美国）；Basic Nucleofec⁃
              成。S1 亚基上的受体结合域能与靶细胞上的受                            tor Kits 转染试剂盒（Lonza 公司，德国）；DMEM 培
                                                                   TM
              体特异性结合，从而决定病毒对细胞的趋向性和                             养液、G418药物、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青链霉
                    ［5］
              致病性 。                                             素双抗和 DPBS 缓冲液（赛默飞世尔科技公司，美
                  已有研究表明血管紧张素转换酶2（angiotensin                   国）。单孔细胞核转染仪（Lonza 公司，德国）；生物
              converting enzyme 2，ACE2）是SARS⁃CoV⁃2的主要功          安全柜（赛默飞世尔科技公司，美国）。引物序列和
              能受体 ，ACE2 的表达是 SARS⁃CoV⁃2 感染靶器官                   磷酸化的寡核苷酸序列（南京金斯瑞公司）。
                    ［6］
              的关键。不同物种的ACE2与SARS⁃CoV⁃2的S蛋白                      1.2  方法
              亲和力表现出差异性，决定了相应物种对 SARS⁃                          1.2.1 ACE2嵌合基因的设计
              CoV⁃2 病毒易感性的不同。如鸡、大鼠、兔等对                               利用DNAstar软件中的Protean模块分析猪和大
              SARS⁃CoV⁃2病毒不易感，而人、水貂、猫等对SARS⁃                    鼠ACE2蛋白的二级结构，使用Chou Fasman算法预
              CoV⁃2 病毒易感。猪作为重要的农业品种之一，与                         测猪和大鼠 ACE2 蛋白α螺旋、β折叠、β转角的比
              人类关系密切，存在着作为中间宿主间接向人类传                            例。使用 Swiss Model 在线（https：//www.swissmodel.
              播 SARS⁃CoV⁃2 的风险      ［7］ 。因此，通过改造猪的              ex pasy.org/）对猪和大鼠ACE2蛋白进行三维建模，然
              ACE2 来构建 SARS⁃CoV⁃2 不易感猪模型有重要现                    后利用Pymol软件比较两者三维结构的相似度，得出
              实意义。ACE2 是由 X 染色体基因编码的锌⁃金属                        均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值。
              肽酶，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有 N 端信号肽、C 端                             在 NCBI 数据库中下载大鼠和鸡的 ACE2 氨基
              结 构 域 和 胞 外 催 化 结 构 域     ［8］ 。 ACE2 除 了 作 为      酸序列，在 DNAMAN 中进行氨基酸序列比对，根据
              SARS⁃CoV⁃2 主要的功能受体，本身还行使促进血                       氨基酸序列的比对结果在大鼠ACE2氨基酸序列的
              管紧张素成熟、调控血管收缩和血压等重要生理                             基础上，将与 SARS⁃CoV⁃2 结合的几个关键氨基酸
                  ［9］
              功能 。因此，构建 SARS⁃CoV⁃2 不易感的猪不能                      残基替换为相应位点鸡 ACE2 的氨基酸残基，并通
              通过直接敲除猪的 ACE2 基因来实现，而应采取策                         过密码子优化获得 ACE2 嵌合基因的基因序列，交
              略 将 猪 内 源 ACE2 替 换 为 与 S 蛋 白 低 亲 和 力 的            由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
              ACE2。                                             1.2.2 靶向猪ACE2的打靶载体构建
                  本研究通过对多个物种的ACE2蛋白序列进行                              根据NCBI数据库中的ACE2基因序列，选取第
              生物信息学分析，构建了与 SARS⁃CoV⁃2 低亲和力                      10外显子设计1对扩增引物，上游引物ACE2_F：5′⁃
              的嵌合ACE2基因片段。然后，利用CRISRP/Cas9基                     CCAGTATGACATGGCTTATGCCAT ⁃ 3′ ，下 游 引 物
              因编辑技术将该 ACE2 整合到猪的 ACE2 基因位                       ACE2_R：5′⁃CCCCAACTGCCTCATGGAAAC⁃3′，以

              点，同时实现猪内源 ACE2 基因敲除和嵌合 ACE2                       长白猪 PFF 细胞的基因组为模板进行 PCR 扩增测
              基因敲入，构建了 ACE2 基因修饰的猪胎儿成纤维                         序，确定是否与数据库中的 ACE2 基因序列一致。
              细胞（porcine fetal fibroblast，PFF）系，为进一步利           使用在线工具 CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/）设
              用 体 细 胞 核 移 植（somatic cell nuclear transfer，      计 sgRNA，合成相应的 2 条 Oligo 片段：5′⁃GCATT⁃
              SCNT）技术构建 SARS⁃CoV⁃2 不易感的猪模型奠定                    AGCTCCATTTCTGAGC ⁃ 3′ 和 5′ ⁃ GCTCAGAAATG⁃
              了基础。                                              GAGCTAATGC⁃3′。利用 BbsⅠ酶切 pX330 质粒，酶
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