Page 13 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第11期 张成霖，方 斌，刘晓蕊，等. 利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系［J］.
2022年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（11）：1499-1506 ·1505 ·

表1 嵌合ACE2敲入的长白猪PFF的基因型
Table 1 Gene type of chimeric ACE2 knock⁃in cell colonies of PFF
序号 测序区域（5′→3′） 类型
WT CCAGTATGACATGGCTTATGCCATACAGCCCTA WT
CCTGCTCAGAAATGGAGCTAATGAAGGTTTCC
ATGAGGCAGTTGGGG
1 CCAGTATGACATGGCTTATGCCATACAGCCCTA +2 564 bp
CCTGCTCGGATCCGGAGCCACCAACTT//GGTT
TTTTGTGTGCGGCGCGAGAAATGGAGCTAATG
AAGGTTTCCATGAGGCAGTTGGGG
2 CCAGTATGACATGGCTTATGCCATACAGCCCTA +2 564 bp
CCTGCTCGGATCCGGAGCCACCAACTT//GGTT
TTTTGTGTGCGGCGCGAGAAATGGAGCTAATG
AAGGTTTCCATGAGGCAGTTGGGG
3 CCAGTATGACATGGCTTATGCCATACAGCCCTA +2 564 bp
CCTGCTCGGATCCGGAGCCACCAACTT//GGTT
TTTTGTGTGCGGCGCGAGAAATGGAGCTAATG
AAGGTTTCCATGAGGCAGTTGGGG
4 CCAGTATGACATGGCTTATGCCATACAGCC +2 564 bp
CTACCTGCTCGGATCCGGAGCCACCAACTT//G
GTTTTTTGTGTGCGGCGCGAGAAATGGAGCTA
ATGAAGGTTTCCATGAGGCAGTTGGGG
注：WT为野生型；1~4为嵌合ACE2敲入成功的细胞克隆；+为碱基插入；标红字母为插入的碱基序列。

A B
LA RA
1 6
DNA：CATTtGCTCCATTTCTGccCTGG DNA：CATTtGaTtCATTTCTGAGCTGG
WT
LA chimeric
2 7
DNA：tAaaAGCTCCATTTCTGAGCAGG DNA：CATTAGtTgCATTTCTGAGaAGG
chimeric
3 8
DNA：gATTAGagCCATTTCTGAGCAGG DNA：CATTAGCTCCATTTCgcAGaTGG
chimeric RA
4 9
Mutant DNA：aATTtGCTCCATTTCTGAGaAGG DNA：CcTcAGCTCCtTTTCTGAGCTGG

5 10
DNA：CAaTAGCTCCATTTCTaAtCAGG DNA：CATTAGCcCCATTTCTtAGaTGG
A：野生型和ACE2敲入的细胞测序结果（部分）；B：脱靶效应检测的测序结果。
图5 嵌合ACE2敲入的细胞克隆测序分析
Figure 5 Sequencing of chimeric ACE2 knock⁃in cell colonies

2014年，Whitworth等 ［16］ 成功制备了CD163双等位基 生理功能异常甚至死亡 ［17］ 。目前尚未出现 SARS⁃
因敲除猪，该基因编辑猪在进行攻毒试验后未表现 CoV⁃2 感染大鼠的报道，但随着病毒在人群和自然
出蓝耳病的临床症状。该研究表明病毒受体基因 界中的不断复制，产生的新变异毒株存在感染大鼠
编辑后能显著提高猪的抗病能力。因此，对猪进行 的风险。但 SARS⁃CoV⁃2 作为一种β属冠状病毒能
基因编辑以降低其对SARS⁃CoV⁃2的易感性是一种 够感染包括人类、家畜在内的哺乳动物，却无法感
可行策略。 染鸟类。因此，本研究采取了一种新的策略来进行

ACE2 是 SARS⁃CoV⁃2 的主要功能受体，ACE2 猪 ACE2 基因的改造。在 SARS⁃CoV⁃2 不易感的大
还参与调节血压、体液平衡和细胞增殖等过程，具 鼠 ACE2 基因的基础上，将与 S 蛋白 RBD 区域直接
有重要的生理功能。ACE2基因缺失会引起动物的 接触的关键氨基酸序列进一步替换为β冠状病毒不