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第42卷第11期       孙立富，季宇萌，王旭枫，等. 邻苯二甲酸二（2⁃乙基己基）酯通过抑制PI3K/AKT信号通路损害人
                 2022年11月         冠状动脉内皮细胞的功能［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（11）：1507-1514 ·1509                ·


                考相关研究的染毒时间和 DEHP 浓度                 ［5，18- 20］ ，将  细胞和坏死细胞分别散布在左下象限和左上象
                DEHP 溶 解 稀 释 于 DMSO，再 与 培 养 基 混 合 ，将              限。定义各组结果为：凋亡率=早期凋亡率+晚期凋
                DEHP 稀释成 128、256、384、512 μmol/L，使 HCAEC           亡率。
                染毒（DMSO终浓度低于0.1%），模拟DEHP暴露。                       1.2.5 蛋白质印迹实验（Western blot）
                1.2.2 细胞增殖⁃毒性实验                                       用 Western blot 评 估 凋 亡 相 关 蛋 白（Bcl ⁃ 2、
                    CCK⁃8试剂盒检测DEHP对细胞增殖能力的影                       cleaved Caspase⁃3、Caspase⁃3、BAX）及 通 路 蛋 白
                响。将细胞以2 000个/孔的密度接种在96孔板中，                       （p⁃PI3K、PI3K、p⁃AKT、AKT）的表达水平。细胞染
                过夜后用显微镜观察，细胞贴壁生长良好，弃去原                            毒72 h后，吸去培养基，用预冷的PBS冲洗细胞。每
                有培养基后，设置空白对照组（无细胞仅有培养                             组细胞用细胞裂解液（RIPA）裂解，裂解液中添加磷
                基）、阴性对照组（DMSO）、实验组（DEHP 128、256、                  酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。4 ℃裂解2 h后，将样
                384、512 μmol/L），每组 5 个复孔，染毒后将 96 孔板               品在 4 ℃下以 15 000 r/min 离心 20 min。使用增强
                放回培养箱继续培养12、24、48、72 h。染毒结束后，                     的 BCA 蛋白质测定试剂盒测量上清液中蛋白质浓

                向每个孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液，继续孵育 2 h，2 h                度，添加5×上样缓冲液后在100 ℃下变性15 min，分
                后用酶标仪检测各组细胞在450 nm处吸光度值，各                         装冻存。通过 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝
                组结果表示为相应阴性对照组细胞活力的百分比，                            胶电泳分离蛋白质，并转移至 0.45 μm 聚偏二氟乙
                根据下列公式计算：（A-C）/（B-C）×100%（A：实验组                   烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。然后，5%牛
                吸光度值，B：阴性对照组吸光度值，C：空白对照组                          血清白蛋白封闭缓冲液室温下封闭 2 h，按照蛋白
                吸光度值）。                                            Marker 位置与目标蛋白分子量裁剪 PVDF 膜，与
                1.2.3 体外成管实验                                      相应的一抗在 4 ℃下孵育过夜。抗体包括 Bcl⁃2
                    制备细胞悬液，调整细胞密度为 1×10 个/mL。                    （1∶1 000）、BAX（1∶1 000）、cleaved Caspase⁃3
                                                       6
                按照每孔50 μL将细胞悬液滴加到预先涂有基质胶                         （1∶1 000）、Caspase⁃3（1∶1 000）、GAPDH（1∶
                的 96 孔板中，设置对照组（DMSO）、实验组（DEHP                     1 000）、p⁃PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p⁃AKT
                128、256、384、512 μmol/L）。轻轻震荡，使细胞分布               （1∶1 000）、AKT（1∶1 000）。第2天在脱色摇床上用
                均匀。在培养箱中常规培养 6 h。用倒置显微镜观                          添加 0.1% Tween⁃20 的 Tris 缓冲盐水将 PVDF 膜洗
                察拍摄细胞成管情况，用 Image J 软件分析图片结                       涤 3 次，每次 15 min，在室温下二抗孵育 2 h，然后
                果，定义至少3条管的交汇处为1个交点，以交点数                           使用上述方法再次洗涤 3 次。使用增强的化学发
                目表示各组成管结果。                                        光试剂，用自动化学发光图像分析系统曝光免疫
                1.2.4 流式细胞实验                                      反应条带。通过 Image J 软件 v1.53 测量每个条带
                    用 Annexin V⁃FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒检                的积分密度，分析相应样品中目的蛋白/GAPDH
                测DEHP对HCAEC凋亡的影响。6孔板常规培养细                         或磷酸化蛋白/总蛋白的比例来计算相对蛋白表达
                胞，设置对照组（DMSO）、实验组（DEHP 128、256、                   含量。
                384、512 μmol/L），在培养箱中常规培养染毒 72 h。                 1.3  统计学方法
                染毒结束后，用不含乙二胺四乙酸（ethylene di⁃                          用 Excel 2019 进行数据录入，SPSS 26.0 进行数
                amine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化并收集细             据的统计学分析，GraphPad Prism 8进行柱状图和折

                胞。细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer                   线图的绘制。本研究各组数据为正态分布且方差
                solution，PBS）漂洗 2 次后，用 100 μL 结合缓冲液重              齐，结果以均数±标准差（x ± s）形式表示，两组间比
                悬细胞，加入 5 μL Annexin V⁃FITC 和 5 μL PI 染色           较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析
                液室温（20~25 ℃）避光孵育10 min。孵育结束后，加                   （One⁃way ANOVA），组间两两比较采用 LSD 检验。
                入400 μL结合缓冲液，轻轻混匀。此外，用未经处理                        以双侧α=0.05 为显著性检验标准，P＜0.05 为差异
                的细胞样品作为阴性对照，用DEHP 256 μmol/L组的                    有统计学意义。
                细胞分别进行Annexin V⁃FITC和PI单染。
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                    在 1 h 内用流式细胞仪检测细胞样品，在双色
                流式细胞仪散点图上，早期凋亡细胞散在分布于右                            2.1 DEHP暴露对HCEAC细胞形态的影响
                下象限，晚期凋亡细胞散在分布于右上象限。存活                                倒置显微镜观察可见（图 1A），72 h 时，实验组
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