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第42卷第11期 张成霖，方         斌，刘晓蕊，等. 利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系［J］.
                 2022年11月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（11）：1499-1506                      ·1501 ·


                切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳（100 V、60 min），                    pX330_ACE2、pX330_sf以及抗性质粒pHY54_ SV40
                切胶回收后纯化。用去离子水将sgRNA Oligo稀释至                      ⁃neo按照Lonza核转染试剂盒说明书建议比例配置，
                100 μmol/L。设置 PCR 仪退火程序：37 ℃ 30 min，              并进行细胞转染，程序为U⁃023。转染结束后，将细
                95 ℃ 5 min，再以 5 ℃/min 的速度降至 25 ℃。将线               胞分盘至 10 cm 培养皿中，细胞培养 24 h 后，用
                性化的 pX330载体与退火产物用T4 DNA连接酶进                       1 mg/mL的G418筛选9~12 d，挑单细胞克隆于24孔
                行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板挑取                          板中，待细胞长满后，消化至 12 孔板中培养。留部
                单菌落测序鉴定正确的重组子，获得 pX330_ACE2                       分细胞在 24 孔板中继续培养，长满后消化并用
                载体。                                               NP40裂解细胞，提取细胞基因组DNA               ［10-11］ 。使用在
                1.2.3 T7E1酶切实验                                    线工具 Cas⁃OFFinder（http：//www.rgenome.net/cas⁃of⁃
                    将转染ACE2打靶载体后的细胞转移到6 cm培                       finder/）寻找潜在的脱靶位点并设计引物。对基因

                养皿中培养，待细胞长满后，消化提取基因组。PCR                          组DNA进行PCR测序鉴定，将基因型鉴定正确且未
                扩增并回收目的片段。T7E1 酶切体系：纯化产物                          发生脱靶效应的细胞克隆进行冻存。
                200 ng；10×NEB Buffer 2 2 μL；去离子水补至19 μL。
                                                                  2  结 果
                在 PCR 仪中进行退火：95 ℃ 5 min；-2 ℃/s 降至
                85 ℃；-0.1 ℃/s 降至 25 ℃；4 ℃保存。体系中加入                 2.1  猪/大鼠ACE2结构的比较

                1 μL T7E1酶，37 ℃孵育90 min。之后每管加入4 μL                    对猪和 SARS⁃CoV⁃2 不易感动物大鼠的 ACE2
                的6×Loading buffer，1%琼脂糖凝胶电泳，1 h后分析                结构进行比较       ［12］ ，利用 DNAstar 软件中的 Protean 模
                结果。根据公式InDel（%）=100×［1-（1-裂解产物占                   块分析猪和大鼠 ACE2 的二级结构，并使用 Chou⁃
                比）］，计算编辑效率。                                       Fasman算法预测猪和大鼠ACE2的α螺旋、β折叠、β
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                1.2.4 ACE2嵌合基因敲入载体构建                              转角的比例。猪 ACE2 的α螺旋占 41.2%，β折叠占
                    在长白猪ACE2第10外显子上的敲除位点上下                        24.7%，β转角占 27.8%（图 1A）；大鼠 ACE2 的α螺旋
                游各选取 40 bp 序列作为同源的左臂（LA）和右臂                       占 40.4%，β折叠占 27.5%，β转角占 28.8%（图 1B），
               （RA），中间加入连接肽（GSG Linker）以及 2A 肽序                   显示猪和大鼠 ACE2 蛋白具有高度相似的二级结
                列，在两同源臂外侧设计相同且反向的sf_sgRNA靶                        构。使用 Swiss Model在线工具对猪和大鼠ACE2进
                点序列（5′⁃GTGCTTCGATATCGATCGTTTGG⁃3′），合              行三维建模，接着利用Pymol软件比较两者三维结构
                成得到 pUC57_ARM⁃2A 载体。利用引物 In⁃Fu⁃                   的相似度，得出RMSD值为0.052，表明两者在三维结
                sion_F：5′⁃GAGAACCCTGGACCTATGTCAAGCTCC⁃            构上亦具有极高的相似性（图1C），因此可以推测猪
                TGCTGGC⁃3′，In⁃Fusion_R：5′⁃ATTAGCTCCATTT⁃          和大鼠ACE2在相应组织或器官内应具有相似的生
                CTCGCGCCGCACACAAA⁃3′，通过 In⁃fusion 克隆将             理功能，使用大鼠ACE2替换猪ACE2具有可行性。
                ACE2嵌合基因插入到经Esp3Ⅰ线性化pUC57_ARM⁃                    2.2  ACE2嵌合基因的合成及猪/嵌合ACE2结构的
                2A载体上，构建ACE2嵌合基因敲入的供体ACE2_KI。                     比较
                    合成2条Oligo片段（sf_sgRNA⁃F：5′⁃GTGCTTC⁃                随着病毒在人群和自然界中的不断复制，新的
                GATATCGATCGTT⁃3′和sf_sgRNA⁃R：5′⁃AACGATC⁃           变异也随之出现，新变异株的产生可能会增加大鼠
                GATATCGAAGCAC⁃3′），退火后与线性化的 pX330                  感染 SARS⁃CoV⁃2 的风险。因此，本研究在大鼠
                载 体 进 行 连 接 构 建 ACE2 嵌 合 基 因 敲 入 载 体              ACE2 的基础上构建大鼠/鸡 ACE2 嵌合基因作为敲
                pX330_sf。                                         入基因。首先，根据大鼠和鸡的 ACE2 的氨基酸序
                1.2.5 细胞转染与单克隆细胞的筛选与鉴定                            列比对结果（图 2A），将 ACE2 与 S 蛋白结合的关键
                    将生长 27 d 的原代长白公猪 PFF 细胞复苏在                    氨基酸位点（第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸
                                               6                  残基）替换为鸡的氨基酸残基。
                6 cm培养皿中，细胞量约为2.6×10 个。使用含16%
                FBS的全培养基（42 mL DMEM 培养液、8 mL FBS                      对嵌合ACE2进行三维建模，并与猪ACE2的三
                和 500 μL 青链霉素双抗），在 38.5 ℃、5% CO2的条                维结构进行比对（图 2B），得出 RMSD 值为 0.054，表
                件下培养约24 h，至细胞融合度＞90%。用0.05%胰                      明改造后的嵌合 ACE2 结构并未发生较大变化，与
                酶消化约 2 min，1 200 r/min 离心收集细胞。将                   猪的 ACE2 仍具有极高的相似性，可以使用该嵌合
                ACE2嵌合基因敲入载体ACE2_ KI和两个打靶载体                       的ACE2来替换猪的ACE2。
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