Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第11期
·1502 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年11月

A Scale C
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
A Alpha，Regions⁃Gamier⁃Robson
A Alpha，Regions⁃Chou⁃Fssman
B Beta，Regions⁃Gamier⁃Robson
B Beta，Regions⁃Chou⁃Fssman
T Turn，Regions⁃Gamier⁃Robson
T Turn，Regions⁃Chou⁃Fssman
C Coil，Regions⁃Gamier⁃Robson
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
B B
Scale
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
A Alpha，Regions⁃Gamier⁃Robson
A Alpha，Regions⁃Chou⁃Fssman
B Beta，Regions⁃Gamier⁃Robson
B Beta，Regions⁃Chou⁃Fssman
T Turn，Regions⁃Gamier⁃Robson
T Turn，Regions⁃Chou⁃Fssman
C Coil，Regions⁃Gamier⁃Robson
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
A、B：猪（A）和大鼠（B）ACE2二级结构，红色表示α螺旋，绿色表示β折叠，蓝色表示β转角；C：猪/大鼠ACE2三级结构比较，红色为猪ACE2
三维建模图，绿色为大鼠ACE2三维建模图；RMSD=0.052。
图1 猪/大鼠ACE2蛋白质二级结构和三级结构分析
Figure 1 Analysis of secondary and three⁃dimensional structures of ACE2 protein between pigs and rats

A ACE2［大鼠］ 100 B
ACE2［鸡］ 100
ACE2［嵌合］ 100
ACE2［大鼠］ 200
ACE2［鸡］ 200
ACE2［嵌合］ 200
ACE2［大鼠］ 299
ACE2［鸡］ 300
ACE2［嵌合］ 299
ACE2［大鼠］ 399
ACE2［鸡］ 400
ACE2［嵌合］ 399
ACE2［大鼠］ 499
ACE2［鸡］ 500
ACE2［嵌合］ 499
ACE2［大鼠］ 599
ACE2［鸡］ 600
ACE2［嵌合］ 599
ACE2［大鼠］ 699
ACE2［鸡］ 700
ACE2［嵌合］ 699
ACE2［大鼠］ 796
ACE2［鸡］ 800
ACE2［嵌合］ 796
ACE2［大鼠］ 804
ACE2［鸡］ 808
ACE2［嵌合］ 804
图2 嵌合ACE2氨基酸序列的比对（A）和三级结构的分析（B）
Figure 2 Comparison of chimeric ACE2 amino acid sequences（A）and analysis of tertiary structures（B）

2.3 载体的构建及靶位点编辑效率检测 中，构建 ACE2 嵌合基因敲入载体（图 3D），使用 In⁃
依据测序确认的长白猪 ACE2 第 10 外显子序 Fusion 引物对敲入载体进行测序验证，测序结果显
列，利用在线工具设计 sgRNA（图 3A）。利用 BbsⅠ 示ACE2嵌合基因敲入载体ACE2_KI构建成功。此
酶将pX330载体线性化（图3B），并与sgRNA退火形 外将两臂外侧的 sgRNA 与线性化的 pX330 载体连
成的双链连接，最后将连接产物进行转化，挑取单 接，将连接产物进行测序验证，测序结果表明打靶
菌落并送测序，测序结果表明 pX330 载体上成功插 载体pX330_sf构建成功（图3E）。
入了猪 ACE 基因靶点的 sgRNA 序列。以转染打靶 2.4 长白猪PFF细胞系ACE2基因靶向编辑过程

载体pX330_ACE2后的细胞基因组为模板进行PCR 将ACE2嵌合基因敲入载体ACE2 KI_pUC57和
扩增，将 PCR 产物退火，再经过 T7E1 酶切，琼脂糖 两个打靶载体 pX330_ACE2、pX330_sf 以及抗性质
凝胶电泳结果显示目的片段被切成两段（图 3C）。 粒pHY54 SV40⁃neo转染长白猪PFF细胞后，Cas9蛋
公式计算得出编辑效率为12.02%。 白会在 sf_sgRNA 和 ACE2_sgRNA 的引导下分别对
利用Esp3Ⅰ酶线性化pUC57_ARM⁃2A载体，同 ACE2 嵌合基因敲入载体 ACE2 KI_pUC57（图 4）和
时根据设计的 In⁃Fusion 引物扩增 ACE2 嵌合基因， 猪的 ACE2 基因第 10 外显子进行剪切，通过同源定
通过无缝克隆技术将ACE2嵌合基因插入敲入载体 向修复机制将含有同源臂的线性ACE2嵌合基因整