Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第3期
               ·312 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年3月


              分析，除Zfp212 mRNA表达模式数据为均数外，其他                      B）；通过卵巢切片和 HE 染色分析小鼠卵泡发育情
              定量数据均用均数±标准误（x ± Sx ）表示，使用t⁃检验                    况，卵泡计数结果显示Zfp212 小鼠各时期卵泡（原
                                                                                           -/-
              进行组间数据比较，P＜0.05为差异有统计学意义。                         始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、早窦和窦状卵泡）数
                                                                量与对照组小鼠卵泡数量差异无统计学意义（P＞
              2  结 果
                                                                0.05，n=3，图3C、D）。由此证实，Zfp212基因敲除不
              2.1  Zfp212在卵母细胞及早期胚胎中的表达模式                       影响雌性小鼠的卵泡发育。
                  为观察Zfp212的表达模式，提取小鼠不同组织                       2.3.2 卵母细胞成熟及早期胚胎发育情况
              和细胞的总 RNA 并反转录为 cDNA，调整 cDNA 浓                         为进一步观察Zfp212 雌性小鼠的卵母细胞能
                                                                                        ⁃/⁃
              度至100 ng/μL后进行RT⁃qPCR。结果显示，Zfp212                 否正常成熟并排卵，利用 8 周龄的雌性小鼠进行超
              在生殖系统中高表达，特别是在雌性小鼠的卵巢和                            数排卵实验，结果显示实验组和对照组小鼠均可排
              生殖细胞中。为了确定 Zfp212 在卵母细胞成熟和                        出成熟的卵母细胞（MⅡ期卵母细胞），统计超排卵
              早期胚胎发育中的时空表达情况，在生殖细胞及                             的数量后发现，Zfp212 小鼠的排卵数量与对照组
                                                                                     -/-
              胚胎发育的多个时间点收样并进行 RT⁃qRCR 定                         相比，差异无统计学意义（P＞0.05，n=4，图 3E）；对

              量，结果显示 Zfp212 mRNA 在 GV 期卵母细胞、MⅡ                  排出的MⅡ期卵母细胞进行体外受精和植入前胚胎
              期卵母细胞和受精卵中均高表达，而在随后的二                             培养实验，进而观察其受精和早期胚胎发育情况，

              细胞期至囊胚阶段表达明显下降（图 1A）；Western                      经统计，Zfp212 基因缺失不影响卵母细胞正常受精
              blot 结果显示 Zfp212 蛋白主要在 MⅡ期卵母细胞                    及植入前胚胎发育（P＞0.05，n=3，图 4A、B）。综上
              中高表达（图 1B）；免疫荧光染色分析了 Zfp212 在                     所述，Zfp212 基因敲除不影响小鼠的卵母细胞成熟
              卵母细胞及各时期胚胎中的定位，结果显示，GV                            和早期胚胎发育。
              期卵母细胞中 Zfp212 蛋白主要定位在细胞核和细                        2.3.3 Zfp212 小鼠生育能力测试
                                                                             -/-
              胞质中，在 MⅠ和 MⅡ期卵母细胞中 Zfp212 主要定                          将 3 只 8 周龄的 Zfp212 雌性小鼠配繁 6 个月，
                                                                                         -/-
              位于纺锤体上，而在受精后至四细胞期几乎观察                             并取 3 只 Zfp212 雌性小鼠作为对照，统计其生仔
                                                                               +/-
                                                                                     -/-
              不到 Zfp212 蛋白荧光定位，直至八细胞期，Zfp212                    情况。结果显示Zfp212 组与对照组的每窝产仔数
              蛋白重新表达并定位在胚胎的细胞质中（图 1C、                           相比，差异无统计学意义（P＞0.05，n=3，图4C）。上
              D）。综上所述，发现Zfp212的表达模式符合母源基                        述实验结果显示，Zfp212 敲除未影响雌性小鼠的生
              因表达特性，因此推测Zfp212可能作为母源因子在                         育能力。
              卵母细胞成熟或早期胚胎发育过程中发挥作用。
                                                                3  讨 论
              2.2  构建Zfp212基因敲除小鼠
                  为进一步探究 Zfp212 在体内是否发挥作用及                           母源因子被证实在受精、表观遗传重编程、减
              其作用机制，以小鼠作为研究模型，借助 CRISPR/                        数分裂到有丝分裂的过渡和早期胚胎发育等生物
              Cas9 技术 ［13-14］ 构建了 Zfp212 基因敲除小鼠（图 2A、           学事件中发挥着关键作用              ［3，15］ 。研究发现，部分
              B）。利用核酸凝胶电泳和 Sanger 测序方法鉴定                        KZFP 作为母源因子在早期胚胎发育和雌性生育力
              Zfp212敲除小鼠的基因型（图2C），并提取了Zfp212                    建立过程中扮演重要角色。哺乳动物母源效应基
              纯合型缺失（Zfp212 ）小鼠的卵母细胞蛋白，通过                        因 锌 指 蛋 白 57（Zinc finger protein 57，Zfp57）是
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              Western blot 检测 ZFP212 蛋白的敲除效率（图 2D），             KZFP 家族成员之一，它通过识别、结合印记控制区
              结果显示 ZFP212 蛋白在 Zfp212 小鼠中被成功清                    （imprinting control regions，ICR），并招募 KAP1 和其
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              除，Zfp212基因敲除小鼠构建成功。                               他的染色质诱导蛋白，驱动 ICR 的甲基化                 ［16］ ，Zfp57

                         -/-
              2.3  Zfp212 雌性小鼠生殖表型分析                            缺失后导致多个ICR的DNA甲基化缺失，最终导致
              2.3.1 卵巢及卵泡发育情况                                   妊娠中期的胚胎死亡           ［17- 18］ ；但 Zfp57 缺失后一些位
                  为观察 Zfp212 基因敲除雌性小鼠的卵泡发育                      点的甲基化水平并未受到影响，进一步探索后，研究
              情况，收取 8 周龄雌性小鼠的卵巢进行形态学分析                          人员发现另一 KZFP——锌指蛋白 445（Zinc finger
              和卵泡计数。首先，通过形态学分析比对，发现8周                           protein 445，Zfp445），其与 Zfp57 在维持部分 ICR 甲
              龄 Zfp212 雌性小鼠与对照组小鼠的卵巢形态、大                        基化中起协同作用，在 Zfp57 缺失的情况下，Zfp445
                      -/-
              小相比，差异无统计学意义（P＞0.05，n=3，图 3A、                     是维持这部分 ICR 甲基化所必需的               ［19］ 。锌指蛋白
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