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第42卷第3期 白 雪，刘 露，胡 月，等. Zfp212基因敲除小鼠模型的建立和雌性生殖表型研究［J］.
2022年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（03）：309-316 ·311 ·

1.2.3 MⅡ期卵母细胞的收集 牛血清白蛋白中室温封闭1 h，最后在 4 ℃条件下孵
向 8~10 周龄的雌性小鼠腹腔注射 5 U PMSG， 育一抗（Zfp212 稀释比为 1∶200）过夜。用 PBS 洗涤
46~48 h后注射5 U HCG，进行超数排卵。HCG注射 3 次洗去多余一抗，然后将卵母细胞或胚胎在相应
后 13~16 h 将膨大的输卵管壶腹剪下，在体式显微 的二抗（稀释比1∶200）中室温孵育1 h，PBS洗涤3次
镜下使用1 mL注射器针头戳破膨大部分，释放出卵 后用 Hoechst 33342（稀释比 1∶500）染核 10 min，洗
丘 ⁃ 卵 母 细 胞 复 合 物（cumulus ⁃ oocytes complex， 涤、封片并通过激光扫描共聚焦显微镜成像。
COC），并在 37 ℃下用 0.5 mg/mL 透明质酸酶消化 1.2.8 实 时 荧 光 定 量 PCR（quantitative real ⁃ time
COC以释放卵母细胞，每组收取50枚MⅡ期卵母细 PCR，RT⁃qPCR）
胞蛋白，用于Zfp212蛋白表达模式验证及Zfp212蛋 用 TRIzol 提取组织、卵母细胞或胚胎中的总
白敲除效率验证，每组收取20枚用于提取RNA。 RNA，并使用 HiScript Ⅱ Q RT SuperMix 将 RNA 逆
1.2.4 体外受精和胚胎培养 转录成 cDNA，NanoDrop 2000C 测定 cDNA 浓度后，
体外受精实验前准备好获能皿、受精皿和培养 将 cDNA 稀释至 100 ng/μL，使用 ChamQ Universal
皿，放置在37 ℃、5% CO2的培养箱中平衡过夜。雌性 SYBR Qpcr Master Mix进行实时荧光定量PCR，检测
小鼠准备工作如上所述，取卵前1 h从成年雄性小鼠 基因表达情况。根据公式 2 -△△CT 计算 Zfp212mRNA
附睾尾收集精子并在人输卵管液（human tubal fluid， 表达含量。2次重复实验验证Zfp212表达模式。RT⁃
HTF）中获能1 h，然后将获能精子加入已拨入COC的 qPCR扩增引物包含以下序列：Zfp212正向引物：5′⁃
受精滴中，孵育4~5 h后，将受精卵在KSOM培养液中 AGAAGCTGGCTGACTTCGAG ⁃ 3′ ，反 向 引 物 ：5′ ⁃
洗去多余精子并放入培养箱中培养至囊胚期。 GCAGACGAAGGACCCAGAAG⁃3′；18s正向引物：5′⁃
1.2.5 生发泡期卵母细胞和各时期胚胎的收集 GTAACCCGTTGAACCCCATT ⁃ 3′ ，反 向 引 物 5′ ⁃
取 3~4 周龄的小鼠卵巢，在体式显微镜下将卵 CCATCCAATCGGTAGTAGCG⁃3′。
巢组织完整地从包膜中剥离出，并用l mL注射器针 1.2.9 组织学分析
头扎破透亮的大卵泡，使 COC 溢出至培养液中，通 8 周小鼠的卵巢组织用 4%的多聚甲醛室温固
过反复吹吸去掉颗粒细胞，得到干净裸露的生发泡 定 4~6 h，然后转移到梯度乙醇溶液中脱水，最后进
（germinal vesicle，GV）期卵母细胞。一细胞期、二细 行石蜡包埋。将石蜡包埋的卵巢块切成 5 μm 的连
胞期、四细胞期、桑葚胚期以及囊胚期的胚胎分别在 续切片，37 ℃温水中展片，捞起展好的切片置于载
受精后12~13 h、24~25 h、46~48 h、71~72 h和96~98 h 玻片上，脱蜡后进行 HE 染色。制片完成后进行卵
收取，卵母细胞或胚胎样本每组收取 50 枚，用于蛋 巢形态学分析和卵泡计数，为了避免对同一卵泡进
白表达模式验证，每组20枚用于提取RNA。 行多次计数，采取每隔两张取一张卵巢切片进行计
1.2.6 Western blot检测 数的方式，除原始卵泡外，只计数具有可见卵母细
按上述时间点收集所需数目的卵母细胞或胚 胞核的卵泡。原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦前
胎，加入8 μL添加了1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶 卵泡和窦卵泡区分标准如下：原始卵泡中含有 1 个
抑制剂的增强型RIPA裂解液，2 μL 5×loading buffer， 卵母细胞，被鳞状颗粒细胞所包围；初级卵泡包含
100 ℃沸水浴5 min，提取卵母细胞和胚胎蛋白。在 1 层立方型颗粒细胞；次级卵泡有 1 层以上颗粒细
200 V 电压下使用 10%的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶分离 胞，无可见窦；早期的窦状卵泡一般只有1到2个小
蛋白，在 300 mA 条件下将蛋白转至 PVDF 膜上，使 窦腔，而窦状卵泡具有1个大窦腔，且均被多层颗粒
用5%脱脂牛奶在室温下将膜封闭2 h后，进行一抗 细胞包围。卵泡计数实验进行了3次生物学重复。
（Zfp212 抗体稀释比为 1∶1 000，Actin、Tubulin 抗体 1.2.10 生育力测试

稀释比为 1∶10 000）孵育，4 ℃孵育过夜后用 TBST 3只成年Zfp212纯合型缺失的雌性小鼠与生育
洗膜 10 min×3 次，相应二抗（1∶5 000）室温孵育 2 h 力正常的 Zfp212 杂合型缺失雄性小鼠交配 6 个月，
后重复上述洗膜步骤，然后滴加超敏型显影液，利 同时将3只Zfp212杂合型缺失雌性小鼠与Zfp212杂
用化学发光成像仪曝光观察。 合型缺失雄性小鼠作为对照组进行配繁，记录并统
1.2.7 免疫荧光（immunofluorescence staining，IF） 计每窝幼崽的数量和出生日期。
卵母细胞或胚胎在 4%多聚甲醛中室温固定 1.3 统计学方法
30 min，然后在0.5% Triton X⁃100中透膜30 min，1% 实验数据利用 GraphPad Prism 8.0.2 进行统计