Page 12 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第3期
·314 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年3月

A
E1 E2 E3 E4 E5

PAM sgRNA1 sgRNA2 PAM
TGCCCGACTGCAGAGCCTGGAGGGGCGTGCAGGGTCAGCGGAGAAGAAGCTGGCTGACTTCGAGAAGACAGCTGTGGAGTT
WT Allele
ACGGGCTGACGTCTCGGACCTCCCCGCACGTCCCAGTCGCCTCTTCTTCGACCGACTGAAGCTCTTCTGTCGACACCTCAA
Editd Allele TGCCCGACT --------------------------------------------------------------------CTGTGGAGTT
（-62 bp） TGCCCGACT --------------------------------------------------------------------CTGTGGAGTT

B
Zfp212 +/+ Zfp212 -/-

Δ62

110 120 130 140 150 160 170 180 160 170
C +/+ +/- -/- D Zfp212 +/+ Zfp212 -/-
Marker Zfp212 Zfp212 Zfp212 Zfp212 55 kDa

—388 bp Actin
—326 bp 43 kDa

A：CRISPR/Cas9靶向敲除策略示意图。B和 C：Sanger测序（B）和核酸凝胶电泳（C）检测Zfp212小鼠基因型。Zfp212 ：野生型；Zfp212 ：
+/-
+/+
杂合子；Zfp212 ：纯合子。D：Western blot检测Zfp212蛋白敲除效率。
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图2 Zfp212基因敲除小鼠模型的构建
Figure 2 Generation of Zfp212 knockout mice

发挥特异性功能。 雌性小鼠的生育能力。
本研究首先通过RT⁃qPCR、Western blot和IF实 虽 然 Zfp212 在 雌 性 生 殖 系 统 中 高 表 达 ，但
验检测Zfp212在多组织或细胞中的表达情况，结果 Zfp212 敲除小鼠呈现出可育表型，可能的解释是
显示 Zfp212 在生殖系统和雌性生殖细胞中优势表 Zfp212 是一个功能冗余基因，基因冗余意味着两个
达，且其表达模式符合母源调控因子表达特征，据 或多个基因执行相同的功能，并且这些基因中的某
此，推测 Zfp212 可能作为母源蛋白，在卵母细胞成 个基因失活对生物表型影响很小或者没有影响。
熟或早期胚胎发育过程中发挥着重要作用。为探 比如，NLR 家族 pyrin 结构域蛋白 9a/b/c（NLR family
究其体内功能，利用CRISPR/Cas9技术，针对Zfp212 pyrin domain containing 9a/b/c，Nlrp9a/b/c）在卵母细
基因的 2 号外显子设计 sgRNA，并利用 DNA 测序和 胞内均有表达，在体外培养条件下，Nlrp9a/b/c 同时
Western blot实验在不同分子水平上验证敲除效率， 突变后胚胎阻滞在二细胞阶段，并且伴随细胞的不
结果显示成功获得 Zfp212 敲除小鼠。Zfp212 小鼠 对称分裂，但任意两个Nlrp9基因突变不会发生二细
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生长发育正常，同时，本研究对 Zfp212 雌性小鼠 胞阻滞现象，说明Nlrp9a/b/c间存在功能冗余 。由
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的卵巢重量和形态进行观察测量，结果显示其与 于 KZFP 家族成员数量庞大，因此推测其家族成员
对照组相比没有明显差异；随后观察了对雌性生 间存在功能冗余；另一方面，如前所述，Zfp708缺失
育力至关重要的几个生物学事件，包括卵泡发育、 虽不影响雌性小鼠的生育能力，但其与 KAP1 协同
［10］
卵母细胞成熟和排卵、受精及早期胚胎发育，一系 调节的表观遗传修饰受到严重影响 ，已有研究表明
列实验结果显示在 Zfp212 雌性小鼠体内，这些关 在体细胞中Zfp212与KAP1之间也存在相互作用 ，
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键的生物学事件均可正常发生，并且与对照组相 但目前尚未在卵细胞中验证Zfp212与KAP1是否相
比无显著性差异；生育力测试结果显示 Zfp212 雌 互作用，以及是否可能协同调控表观遗传修饰。因
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性小鼠可正常生育后代，并且产仔数量与对照组 此，需要进一步探索 Zfp212 与 KAP1 是否存在相互
无明显差异。因此得出结论，Zfp212 缺失不影响 作用，及其对表观遗传修饰的影响，并通过转录组