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第42卷第3期         孙重期，束永前，毛文君. 多肽组学分析揭示内源性多肽对肺腺癌恶性表型的关键作用［J］.
                  2022年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（03）：317-324                       ·319 ·


                KEGG 数据库（https：//www.kegg.jp/）进行比对，对其             养24 h，取出换液后，用10 μL移液器吸头沿板底部
                进行功能注释和通路富集；利用在线工具Open Tar⁃                       作“︱”字形划痕，用灭菌的PBS洗涤细胞，更换培养
                gets Platform（www. targetvalidation.org/）预测这些差    基。按 0~48 h的时间点，在倒置显微镜下寻找“十”
                异多肽相关前体蛋白与肺癌之间的关系；通过网站                            字交叉处确定划痕边缘并拍照。测量前后两次照片
               （https：//string⁃db.org）对差异前体蛋白进行蛋白互                固定点划痕边缘的相对距离，并计算不同时间点相对
                作网络（protein protein interaction network，PPI net⁃  距离的差值，以此数据判断细胞迁移能力的大小。
                work）分析。                                          1.3  统计学方法
                1.2.4 细胞培养和多肽制备                                       使用 SPSS25.0 统计软件，部分作图使用 Graph⁃
                    人肺腺癌细胞株 A549 和 H1975 细胞购自中国                   pad Prism 8以及R（version 4.0.5）。本研究所有实验
                科学院上海生命科学研究院细胞库。细胞传代培                             数据均用均数±标准差（x ± s）表示；通过配对t 检验
                养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中，置于                    和双因素方差分析进行组间比较分析，P <0.05为差

                5%CO2、37 ℃恒温培养箱中进行常规培养。每隔2 d                      异有统计学意义。
                用EDTA⁃胰酶消化传代。取对数生长的细胞用于后
                                                                  2  结 果
                续实验。相关多肽由南京金斯瑞生物公司定制合成，
                获得后溶解于无菌蒸馏水（疏水性的多肽溶解时使用                           2.1  肺腺癌组织和癌旁组织分泌的内源性多肽对
                冰上超声处理 3 min），储存于-40 ℃冰箱中。                        A549和H1975细胞恶性表型的影响
                1.2.5 CCK⁃8实验                                         将年龄匹配的 3 例男性肺腺癌患者的癌组织
                    取对数生长期的 A549 和 H1975 细胞，以每孔                  （LC 组）和癌旁组织（PC 组）研磨提取上清后，SDS⁃
                4 000 个接种于 96 孔细胞培养板，每孔加入 200 μL                  PAGE 胶结果显示研磨组织上清中的确含有许多
                培养基，正常培养过夜。按试验要求处理细胞（每                            14 kDa 以下的小分子多肽（图 1A）。后续通过相关
                组3个平行孔，独立重复3次），加入等体积PBS做为                         实验提取组织中的小分子多肽，为了验证两组多肽
                对照，分别置于培养箱培养0~48 h 后，移除培养基，                       是否有功能，将两组多肽以20 μmol/L的浓度加入到
                每孔加入提前配制的10% CCK⁃8溶液100 μL，1~2 h                  肺腺癌细胞株A549和H1975中。CCK⁃8结果显示，
                后于波长450 nm测各孔吸光度值。                                与 PBS 对照组相比，LC 组多肽显著促进了 A549 和
                1.2.6 Transwell实验                                 H1975 的 增 殖 ，而 PC 组 多 肽 则 抑 制 了 A549 和
                    收集饥饿培养12 h的细胞，制备细胞悬液。取                        H1975 的增殖（图 1B、C）；Transwell 实验显示 LC 组
                出 Transwell 小室置于 24 孔板中，小室上层加入无                   多肽能促进 A549 和 H1975 细胞的迁移能力，PC 组
                血 清 RPMI1640 培 养 基 200 μL，下 层 加 入 含 有             多肽则能抑制 A549 和 H1975 细胞的迁移能力（图
                BSA 或小分子多肽的 RPMI1640培养基650 μL；取                   1D）。这些结果提示，肺腺癌组织分泌的多肽可能
                稀释过的Matrigel 30 μL加到Transwell上室，在37 ℃             促进肺腺癌细胞株的恶性表型，而癌旁组织分泌的
                下孵育2 h，使Matrigel聚合成胶（研磨组织提取上清                     多肽则具有抑制肺腺癌细胞株恶性表型的能力。
                仅做迁移实验）。将细胞悬液（细胞数约 5×10 个）                        2.2  肺腺癌和癌旁组织分泌多肽的基本特征
                                                          4
                加入小室内，置于 5% CO2 37 ℃的恒温培养箱静置                          以LC⁃MS/MS技术鉴定了上清中分泌的4 538条
                培养24 h。取出小室，室温下用甲醛固定15 min，去                      多肽，结果发现了 242 条在两组间有差异表达的多
                除固定液后予结晶紫染色，用棉签擦去孔膜上层的                            肽，共关联202个前体蛋白（部分前体蛋白关联数个
                细胞，在烧杯中反复用清水漂洗小室，用倒置显微                            多肽）；其中，相对于PC组，LC组中有低表达的多肽
                镜拍摄膜底层的细胞，每个小室至少取5个视野，统                           95 条，差异高表达的多肽 147 条（差异倍数≥2.0，
                计细胞数目，从而判断细胞侵袭能力。                                 FDR<0.05）（图 2A、B）。通过在线工具计算了这些
                1.2.7 划痕实验                                        差异多肽的分子量和等电点，其分子量主要分布在
                    制备培养单层细胞，用针头在 6 孔板底部划出                        ≥2 000、700~＜900、500~＜700 Da这3个区间；等电
               “一”字线，可作为后续拍照、观察的位点，将适当密                           点主要分布在 10~＜11、8~＜9、9~＜10 这 3 个区间
                度的细胞（1×10 个/孔）接种于6孔板中，各样本均设                      （图2C、D）。先前研究发现，内源性多肽的功能往往
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                3 个复孔，37 ℃静置过夜后，分别接受相应的处理。                        与其前体蛋白的功能相关，为了寻找这些差异多肽
                将处理过的细胞置入5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培                        前体蛋白的潜在功能，进一步进行了 GO 分析和
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