Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第3期
               ·318 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年3月


              85%左右，其5年生存率仅为23%，远远低于乳腺癌                         腺癌患者的肿瘤组织和相邻的癌旁非肿瘤组织，
              和结直肠癌 。手术仍是早期和某些局部晚期肺                             3 例患者为年龄相匹配的男性，术前均未进行手术、
                         ［2］
              癌（Ⅰ~ⅢA 期）的主要治疗手段。但根据统计，约                          放化疗及介入等治疗，且术后均得到明确的病理学
              2/3 的肺癌患者确诊时已处于局部进展期或有远处                          诊断。本研究已经过医院伦理审查委员会批准，所
                  ［3］
              转移 ，针对这部分患者，单纯的手术治疗已无法满                           有患者在收集前均被告知参与研究并签署知情同
              足需求。近年来，除了传统的化学治疗手段，靶向                            意书。所有标本均在术后迅速放入液氮中冷冻保
              治疗及免疫治疗的问世使得NSCLC治疗进入“个体                          存，以备下一步的多肽提取。
              化治疗”和“精准治疗”的时代。但是，以一代表皮                           1.1.2 主要试剂和材料
              生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR⁃TKI）吉非                             RPMI 1640细胞培养基、PBS、EDTA⁃胰酶、青霉
                                                       ［4］
              替尼为例，存在 20%~30%的原发性耐药患者 ，且                        素、链霉素、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；苯甲基磺
              只有少部分患者具有 EGFR 的敏感突变（白种人群                         酰氟、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、乙腈、蛋白酶抑制剂
              10%~20%，东亚人群约48%） 。而新兴的免疫治疗                       混合物（Sigma⁃Alrich 公司，美国）；Cell Counting Kit
                                       ［5］
              也只能使15%~25%的NSCLC患者获益，多数患者对                       8（CCK⁃8）细胞增殖检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂
                                                 ［6］
              免疫检查点抑制剂药物存在原发性耐药 。因此，亟                           盒、SDS⁃PAGE凝胶配制试剂盒、考马斯亮蓝染色液、
              待开拓新的治疗手段，为临床上更多的肺癌患者提                            蛋白裂解液（上海碧云天公司）；TMT蛋白标记试剂盒
              供持续、稳定的生存获益。                                      （Thermo Fisher公司，美国）；10 kDa MWCO超滤离心
                  近年来，小分子多肽类化合物因其分子量小、                          管（Millipore公司，美国）；相关多肽由南京金斯瑞生
                                                         ［7］
              靶向性强、活性高、毒性低、易于跨膜吸收等优点 ，                          物公司合成。
              成为肿瘤防治领域研究的热点之一。研究人员目                             1.2  方法
              前已证实，多种肽类化合物可以作用于肿瘤细胞自                            1.2.1 多肽提取和纯化
              身的靶点，诱导细胞凋亡和坏死等进而杀伤肿瘤细                                 收集适量的各个样品进行多肽提取。样品液
              胞；此外，它们还可以通过作用于肿瘤组织微环境中                           氮研磨后加入蛋白裂解液，吹打混匀后加入蛋白酶
              的新生血管和免疫细胞发挥抗肿瘤作用                 ［8-12］ 。例如多     抑制剂混合物（终浓度为 1 mmol/L PMSF、2 mmol/L
              肽peptide 1通过减少血管生长因子的表达而抑制卵                       EDTA、10 mmol/L DTT），混合，冰上超声10 min。接
                              ［9］
              巢癌细胞的侵袭 ；多肽 MTP⁃NeuNT 能通过抑制                       着样品于 4 ℃以 12 000 r/min 离心 30 min，收集上清
              ErbB2的活性从而抑制乳腺癌细胞的生长和转移 。                         液。使用 10 kDa 超滤离心管再次离心以收集过滤
                                                        ［13］
                  随着多肽组学技术的发展，该技术已经成功应                          液并去除蛋白质和大于10 kDa的多肽，测定蛋白质
              用于多种疾病的诊断和治疗。针对人体组织的多                             浓度。上清液通过 Speed⁃vac 系统真空干燥并立即
              肽组学分析，是以机体内源性多肽和低分子量蛋白                            在-80 ℃冷冻直至使用。
              质为研究对象，研究多肽组的结构、功能、变化规律                           1.2.2 多肽标记和LC⁃MS/MS
              及其相关关系，来提供蛋白质水解活动以及潜在生                                 将样本根据来源分为癌组织组（LC 组）以及癌
              物活性肽的重要信息          ［14］ 。尽管多肽抗肿瘤的研究               旁组织组（PC 组），依照制造商的说明使用 5 μL
              受到越来越多的关注，但内源性多肽在肺癌中的作                            TMT试剂标记样品，将标记的样品混合并同时通过
              用却鲜有报道。本研究使用液相色谱⁃串联质谱                             纳升级液相色谱（Easy⁃nLC，Thermo Fisher Scientific
              法（liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry，  公司，美国）以及轨道阱质谱仪（LTQ⁃Orbitrap Velos
              LC⁃MS/MS）技术鉴定肺腺癌组织和癌旁组织中分泌                        mass spectrometer，Thermo Fisher Scientific 公司，美
              的多肽，探讨这些内源性多肽与肺腺癌恶性表型之                            国）对标记的肽进行分析。所有相关实验均在南京
              间的关系，以期为寻找肺癌治疗的新靶点提供一定                            医科大学检测中心（http：//fxcszx.njmu.edu.cn/）完成。
              帮助。                                               1.2.3 生物信息学和生物活性肽筛选
                                                                     通过在线工具 Protparam（http：//web.expasy.org）
              1  材料和方法
                                                                计算多肽的分子量（molecular weight，MW）以及等电
              1.1  材料                                           点（isoelectric point，PI）。癌和癌旁差异表达的多肽
              1.1.1 样本收集                                        相关的前体基因通过在线工具 DAVID（（http：//da⁃
                  收集2020年2月无锡市人民医院初诊的3例肺                        vid.abcc.ncifcrf.gov/）与 GO 数据库（Gene Ontology）、
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