Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第3期
·310 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年3月

ed protein，YAP）对于胚胎合子基因组的激活至关重 tor、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix、SYBR Qpcr Master
要，利用基因编辑技术特异性敲除母源Yap后，胚胎 Mix（南京 Vazyme 公司），AxyPrep PCR Cleanup Kit
表现出二细胞阶段的延长并且胚胎发育至四细胞 （Axgen 公司，美国），孕马血清促性腺激素（pregnant
［5］
的速度明显减慢 ；合子阻滞因子 1（zygotearrest 1， mare serum gonadotropin，PMSG）、人绒毛膜促性腺激
Zar1）缺失的雌性小鼠无法正常怀孕，同时Zar1缺失 素（human chorionic gonadotropin，HCG）（浙江三生药
的胚胎大多阻滞在一细胞期，也有部分阻滞在二细 业），人输卵管液（human tubal fluid，HTF）（江苏易核
［6］
胞时期 ；热休克转录因子 1（heat shock transcrip⁃ 公司），EmbryoMax Advanced KSOM Embryo Medium
tion factor 1，Hsf1）是较早发现的母源效应基因，母 （KSOM）、二 氟 化 树 脂 膜（polyvinylidene fluoride，
源 Hsf1 的缺失同样会导致雌性不孕及合子期胚 PVDF membrane）（Millipore 公司，美国），RIPA lysis
胎发育的停滞 ［7］ 。因此，揭示关键母源因子的功 buffer、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（康为世纪公
能对研究和解释雌性不孕及早期胚胎发育障碍 司），化学发光试剂盒（杭州弗德生物公司），多聚甲
至关重要。 醛（PFA）、伊红（Sigma 公司，美国），TRIzol Reagent
锌指蛋白 212（Zinc finger protein 212，Zfp212） （Invitrogen 公司，美国），苏木素（武汉 Servicebio 公

是 Krüppel 相关盒型锌指蛋白（Krüppel⁃associated 司），Zfp212抗体（赛默飞世尔公司），β⁃TUBULIN 抗
box domain zinc finger protein，KZFP）家族的一员，其 体（Abclonal 公司，美国），ACTIN 抗体（Santa Cruz 公
TM
N 端包含一个 Krüppel 相关盒（Krüppel⁃associated 司，美国），荧光二抗 Alexa Fluor 555 donkey anti⁃
box，KRAB），C 端排列着 4 个半胱氨酸⁃组氨酸锌指 rabbit IgG（Invitrogen 公司，美国），HRP 标记的 Goat
结构域。研究报道，KZFP 参与胚胎发育、细胞增 anti⁃Mouse IgG（H+L）secondary antibody、HRP 标记
［8］
殖、分化、凋亡和癌症等多种生物学过程 ，但KZFP 的 Goat anti ⁃ Rabbit IgG（H + L）secondary antibody，
最为人们所熟知的作用是在早期胚胎发育过程中 （Invitrogen公司，美国）。
募集 KRAB⁃相关蛋白 1（KRAB⁃associated protein 1， 1.2 方法
［9］
KAP1） 。KAP1 是小鼠和人类的 KRAB 结合辅因 1.2.1 Zfp212基因敲除小鼠模型的构建
子，它与组蛋白甲基转移酶 SETDB1（SET domain， 利用CRISPR/Cas9技术构建Zfp212基因敲除小
bifurcated 1）、异染色质蛋白 1（heterochromatin pro⁃ 鼠 ［12］ ，Cas9 mRNA 由南京医科大学生殖医学国家重
tein 1，HP⁃1）、核小体重塑和脱乙酰（nucleosome 点实验室沈彬教授课题组提供。sgRNA 设计在
remodeling and deacetylase，NuRD）复合物和 DNA 甲 Zfp212基因的2号外显子上，两条sgRNA序列如下：
基转移酶1、3A、3B共同组成沉默复合体 ［10］ 。因此， 5′⁃GCCCCTCCAGGCTCTGCAGTCGG⁃3′和 5′⁃TGA⁃
KZFP 通过 KAP1 介导的异染色质形成和 DNA 甲基 CTTCGAGAAGACAGCTGTGG ⁃ 3′ 。 将 Cas9 mRNA
化抑制转录并在胚胎表观遗传重编程过程中发挥 和sgRNA同时注射到受精卵中，然后将受精卵移植
作用 。 到假孕小鼠子宫内，使之继续发育，获得F0代小鼠。
［9］
最近，Zfp212 被证明与 KAP1 之间存在相互作 1.2.2 小鼠基因型鉴定及 Zfp212 纯合型缺失小鼠
用 ［11］ ，本 研 究 利 用 CRISPR/Cas9 技 术 成 功 构 建 的获得
Zfp212 基因敲除小鼠，并对雌性小鼠生殖表型进行 从基因编辑小鼠脚趾中提取 DNA，利用 Rapid
了分析，探索 Zfp212 是否具有母源效应，以及其在 Taq master mix、引物、双蒸水配制 PCR 体系，进行
雌性生育力建立过程中是否发挥重要作用。 目的片段扩增。将 PCR 扩增产物纯化并克隆到
pCE2 TA/Blunt⁃Zero 载体中，然后进行 Sanger 测序，
1 材料和方法
使用Vector NTI（11.5版）比对测序结果，确定其基因
1.1 材料 型以筛选出符合要求的基因缺失小鼠。将选定的
C57BL/6 小鼠饲养在无特定病原体（specific F0代小鼠与野生型小鼠杂交以纯化背景，然后将得
pathogen free，SPF）条件下，饲养室温度20~22 ℃，湿 到的 F1 代小鼠杂交，最终获得 Zfp212 基因 2 号外
度50%~70%，光照时间遵循小鼠的昼夜节律。所有 显子 62 对碱基对缺失的纯合型F2代小鼠。PCR所
小鼠实验均经南京医科大学动物管理和伦理委员 需 Zfp212 基因引物序列如下：正向引物 5′⁃CACTG⁃
会（批准编号：IACUC⁃1908013⁃1）批准。 GCCTTGTCTCCTCAATC⁃3′、反向引物 5′⁃CAGAC⁃
Rapid Taq master mix、pCE2 TA/Blunt⁃Zero vec⁃ GAAGGACCCAGAAGTT⁃3′。